يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الطب التجديدي، مثل حيث يمكن أن تكون الخلايا الجذعية للجريب الأسنان البشري هندستها وراثيا لتحسين خصائصها العلاجية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الخلايا الجذعية يمكن تعديلها عن طريق إدخال ميكرورنا دون خطر التكامل الجينومي المستقر. بدء عملية الهضم الأنزيمية من الجريبات اثنين، قبل الاحترار لدرجة حرارة الغرفة، الإنسان خلية جذعية جريب الأسنان أو hDFSC ثقافة المتوسطة وPBSPSG الحل.
ذوبان aliquot واحد كل من كولاجيناز نوع الأول وحلول الأسهم Dispase الثاني. إعداد حل الهضم عن طريق إضافة 500 ميكرولترات من نوع كولاجيناز حل الأسهم الأول و 500 ميكرولترات من حل الأسهم Dispase II إلى 4 ملليلتر من متوسطة البازل التي تحتوي على 1٪ عامل المضادات الحيوية. لتجنب التلوث في الموقع أثناء الخلايا الجذعية عزل الخلايا الجذعية الجذعية بريب الخلايا البشرية يجب أن تحتوي وسائل الإعلام المستخدمة على عوامل المضادات الحيوية.
ضع بصيلات الأسنان المستخرجة في طبق بيتري معقمة. إضافة 10 ملليلتر من حل PBSPSG لغسل الأنسجة المستخرجة. التعرق وتجاهل الحل وإضافة حل PBSPSG جديدة لتكرار غسل.
باستخدام مشرط مشرط معقم مستخرجة بصيلات إلى قطع إذا كان حوالي 1 في 1 ملليمتر. نقل الأنسجة المفروم وPBSPSG حل من طبق بيتري في أنبوب جهاز طرد مركزي مخروطي 50 ملليلتر، وغسل طبق بيتري مع 10 ملليلتر من حل PBSPSG، ونقل الحل في نفس الأنبوب. الطرد المركزي أنبوب المخروطية في 353 س ز في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق.
إضافة 5 ملليلتر من حل الهضم إلى الأنسجة المنصة، بلطف خلط الحل والأنسجة، واحتضان الخليط في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة اهتزاز لمدة ساعتين. بعد ساعتين، الطرد المركزي تعليق الخلية والأنسجة المهضمة في 353 غرام لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل عظمى وإعادة تعليق البليت التي تم الحصول عليها في 6 ملليلتر من HDFSC ثقافة المتوسطة.
بذور تعليق الخلية في قارورة ثقافة خلية 25 سم مربع، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية. بعد حصاد الخلية وتوصيف HDFSC هو كما هو موضح في بروتوكول النص، hDFSCs البذور في 24 جيدا خلية لوحة ثقافة. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 20٪ أوكسجين لمدة 24 ساعة.
في اليوم التالي تمييع 40 picomoles من ميكرورنا في 66.7 ميكرولترات من متوسطة المصل مخفضة، ودوامة الحل. تمييع 0.67 ميكرولترات من الدهون الموجبة على أساس، كاشف transfection في 66.7 ميكرولترات من متوسطة المصل مخفضة، دوامة الحل، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق إضافة microRNA قبللوت إلى كاشف إعادة الإرسال قبللوت، مزيج الحل، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس عشرة دقيقة.
بعد ذلك، إضافة تعقيدات transfection المعدة، dropwise، مباشرة إلى الوسط ثقافة على الخلايا. مزيج بلطف عن طريق هزاز 24 لوحة ثقافة الخلية جيدا ذهابا وإيابا. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
بعد 24 ساعة من عملية الانتـرـض، جمع المـاكر من العينات في أنابيب أجهزة الطرد المركزي المخروطية ذات الـ 15 ملليلتر. اغسل الخلايا بـ 1 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، ونقل برنامج تلفزيوني إلى أنبوب الطرد المركزي المعني. إضافة 500 ميكرولترات من التنقيط وEDTA إلى الخلايا، واحتضان لوحة 24 جيدا في 37 درجة مئوية، لمدة 3 دقائق.
وقف التربسيناتية عن طريق إضافة 1 ملليلتر من خلية ثقافة المتوسطة للخلايا، ونقل الحل إلى أنبوب الطرد المركزي المعنية. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 س ز و 4 درجات مئوية لمدة عشر دقائق. من هنا فصاعدا الحفاظ على الخلايا والكواشف على الجليد ما لم يذكر خلاف ذلك.
تجاهل supernatant، resuspend الخلايا في 100 ميكرولترات من المخازل تلطيخ، ونقل حل الخلية إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 ملليلتر. إضافة 0.5 ملليلتر من صبغة رد الفعل أمين لكل عينة من أجل التمييز بين الخلايا الحية والميت. خلط بلطف الحل، واحتضان في 4 درجات مئوية لمدة عشر دقائق.
إضافة 1 ملليلتر من برنامج تلفزيوني إلى الخلايا، والطرد المركزي في 300g و 4 درجات مئوية لمدة عشر دقائق تجاهل الخلايا الفائقة و resuspend في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني، إضافة 33 ميكرولترات من paraformaldehyde، وخلط الحلول، وتخزين العينات في 4 درجات مئوية محمية من الضوء حتى تدفق القياسات السيتونية. نقل العينات إلى أنابيب مناسبة لقياسات تدفق السيتوميترية، وتنفيذ عملية التتمتري التدفق باستخدام استراتيجية الغاتة الموصوفة في بروتوكول النص. أظهرت الخلايا الجذعية لجريب الأسنان البشري المعزول جميع الخصائص الموصوفة لتعريف الخلايا السترومية المتوسطة ، وكانت الخلايا من البلاستيك الملتمسة وعرضت الألياف الزجاجية مثل مورفولوجيا ، في ظل ظروف الثقافة القياسية.
وكشف التحليل السيتري للتدفق أن مراكز التحلل (hDFSCs) قد عبرت عن لوحة من مستضدات سطحية معينة، بما في ذلك CD29 و CD44 و CD73 و CD90 و CD105. بينما كان CD45 وDC117 غائبة. أكّدت ال [إدبوجيني], [أوستيوثين], و [غندروين] تمايز إمكانيات من خلايا تحت خاصّة في فيترو ثقافة شروط كان ب [إينتّر] مناعة, بروتين [دّكّي] ربط ل: [أوستيوكالسين], و [أغريكن].
استراتيجية الغاء المستخدمة في القياس الكمي للسمية الخلوية وCy3 المسمى microRNA كفاءة امتصاص 24 ساعة بعد transfection، وأكد امتصاص ميكرورنا في 100٪ من الخلايا القابلة للحياة. وتشير كميات مماثلة من الخلايا الميتة في العينات المصابة بالعدوى وغير المنقولة إلى أن ميكرورنا يتم إدخالها بكفاءة دون آثار سمية للخلايا. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ أساليب أخرى مثل التمايز من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل اللدونة Cytolab.
