Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul morbo di Alzheimer, in particolare i primi eventi coinvolti nel collasso del cono di crescita. Il principale vantaggio di questa tecnica è quello di rendere possibile visualizzare e analizzare i coni di crescita assonale immediatamente dopo il trattamento beta amiloide. Inizia usando micro-forbici per tritare cortici cerebrali appena isolate da topi embrionali day-14 in mezzo di coltura neuronale senza antibiotici.
Raccogliere i tessuti e centrifugare i tessuti a 87G per tre minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante e aggiungere due millilitri dello 0,05% di triptina al pellet. Incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius e mescolare toccando ogni cinque minuti.
Dopo 15 minuti, aggiungere quattro millilitri di A medio per neutralizzare la tripina e mescolare toccando. Quindi centrifugare i tessuti a 178 volte G per tre minuti. Dopo aver rimosso il supernatante, aggiungere la soluzione inibitore della DNASI e della soia tripside e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius con miscelazione ogni cinque minuti come prima.
Quando il tempo di incubazione è trascorso, aggiungere quattro millilitri di medio A.Mescolare e centrifugare come prima. Dopo aver rimosso il supernatante, aggiungere quattro millilitri di medio A e triturare i tessuti con una pipetta Pasteur lucida fino a quando non si osservano detriti. Quindi, filtrare i tessuti triturati con una rete delle dimensioni di un poro da 70 micron.
Dopo la filtrazione, contare le cellule con un emocitometro e calcolare la densità cellulare. Pipetta 0,8 per 10 alla quarta celle nel mezzo A in ogni pozzo di una diapositiva di coltura di otto pozzi. Quindi incubare in un'atmosfera umidificata del 10%CO2 a 37 gradi Celsius.
Dopo quattro ore di coltura, cambiare il mezzo di coltura a medio B.La purezza dei neuroni che utilizzano questo metodo è di circa il 75%Inizia questo saggio con almeno una settimana di anticipo aprendo una fiala fresca di A beta 42 a figura intera ottenuta commercialmente e sciogliendo il contenuto in acqua sterile distillata a una concentrazione di 0,5 millimolare. Incubare a 37 gradi Celsius per sette giorni per indurre aggregazione e tossicità. Preparare le aliquote di A beta 1-42 aggregato e conservare a meno 80 gradi Celsius fino all'uso.
Il quarto giorno della coltura neuronale, trattare i pozzi con 100 microlitri di 0,5 micromolari aggregati A beta 1-42 o soluzione del veicolo nel mezzo B per un'ora come precedentemente dimostrato. Trascorso l'ora, rimuovere il mezzo di coltura e fissare immediatamente i neuroni con paraformaldeide al 4% contenente il 4% di saccarosio in PBS per un'ora a 37 gradi Celsius su una piastra calda. La fissazione è molto importante in quanto mantenere la forma dei coni di crescita è fondamentale per questo protocollo.
Dopo la fissazione, lavare i neuroni tre volte con PBS. Quindi, dopo aver rimosso la camera, montare i neuroni con un mezzo di montaggio acquoso. Asciugare il mezzo di montaggio a quattro gradi Celsius per due o quattro giorni.
Cattura l'intera area di ogni pozzo con una lente obiettivo a secco 20X su un microscopio invertito. Catturare e analizzare l'intera area in ogni pozzo è importante per evitare la soggettività. Classificare i neuriti più lunghi di ciascun neurone nello stadio tre o quattro come assoni.
I coni di crescita assonali privi di lamellipodia o che possiedono meno di tre filopodi sono considerati coni di crescita collassati. Un oligomero beta 1-42, mostrato qui prima dell'incubazione, si aggrega dopo sette giorni di incubazione a 37 gradi Celsius. Dopo il trattamento con A beta 1-42 aggregato, l'immunostaining con un anticorpo per l'oligomero tossico di A beta mostra una colorazione positiva in rosso su neuroni trattati con A beta 1-42, ma non neuroni trattati con veicoli.
I primi fenomeni indotti dal trattamento A beta 1-42 sono stati analizzati dopo quattro giorni di coltura. Gli assoni identificati sono stati confermati come tali dall'immunostaining positivo per il marcatore assonale tau-1 mostrato in rosso e negativo immunostaining per il marcatore dendritico, MAP-2, mostrato in verde. Dopo un'ora di trattamento del veicolo, i coni di crescita avevano diffuso lamellipodia e diversi filopodi.
Questi sono stati identificati come coni di crescita sani. Al contrario, un'ora di trattamento con Beta 1-42 ha portato a coni di crescita rimpiccioliti, che non hanno sviluppato lamellipodia o filopodia. Questi sono stati identificati come coni di crescita crollati.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di correggere al meglio le celle con 4%PFA e 4% di saccarosio a 37 gradi Celsius per il mio protocollo di fissazione. Seguendo questo protocollo, è possibile eseguire altri metodi come l'imaging a cellule vive e la trasfezione genica per rispondere a domande aggiuntive come quando e come i coni di crescita dell'assone vengono collassati e come vengono recuperati i coni di crescita collassati.
