L'immunoterapia combinata con la chemioterapia rappresenta un approccio innovativo per sviluppare una terapia efficiente nel cancro. Gli obiettivi principali sono raggiungere effetti sinergici e terapeutici, riduzione della dose e della tossicità e ridurre al minimo o ritardare l'induzione della resistenza ai farmaci. Tuttavia, per motivi pratici ed etici, non è possibile determinare la sinergia nei pazienti. Pertanto, prima della combinazione diretta negli studi clinici, devono essere effettuati studi di combinazione prenicaptor, in vitro e/o negli animali, per ottenere la logica per gli studi clinici. Un semplice metodo robusto per la quantificazione della sinergia tra farmaci si basa sull'equazione dell'indice combinato sviluppata da Shouan Talale, come illustrato in questo video. Usando questo metodo, e la sua simulazione computerizzata, evidenzeamo qui, il sinergismo tra l'anticorpo monoclonale 8B6, che è specifico per l'antigene del neuroblastoma Ganglioside O-Acetyl-GD2 e il farmaco chemioterapico Topotecan sulle cellule del neuroblastoma. In breve, dopo aver determinato la dose efficace 50 valori di ciascun composto nell'IMO umano, 5 linee cellulari di neuroblastoma, queste cellule sono state intubate con rapporti equi dei due composti e i valori dell'indice combinato sono stati calcolati utilizzando la simulazione automatica al computer. Abbiamo poi confermato questi risultati in Vivo, in un modello imo, 5 tumore xenofobo. Abbiamo coltivato cellule IMR-5 in un pallone T75, le abbiamo osservate al microscopio, per controllare la confluenza cellulare. Mezzo cellulare asperato dal pallone, lavare con 5 ml di PBS. Aggiungere 3 mL di soluzione EDTA/PBS 0,05%.. Riportare il pallone nell'incubatrice per 3 minuti. Esaminare la coltura cellulare al microscopio per il distacco cellulare. Aggiungere 10 ml di mezzo cellulare completo al pallone e trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico sterile da 15 ml. Centrifugare per cinque minuti a 300 g.Contare le cellule usando un emocitometro. Rimuovere e scartare il supernatante. Sospendere le celle in in Complete Growth Medium.Regolare il volume medio per ottenere la concentrazione finale di 100.000 celle/mL.Semi 84 pozzi, 96 piastre di coltura del pozzo con 10.000 celle ciascuna, otteniamo 100 microlitri di sospensione cellulare. Incubare le cellule per 18 ore nell'incubatore di cellule.Diluire l'anticorpo monoclonale in 500 microlitri di Complete Growth Medium per ottenere una soluzione di lavoro anticorpale con una concentrazione di anticorpi monoclonali 240 micro-grammi per mL.Eseguire 5 delusioni seriali due volte come indicato nel protocollo. Diluire il farmaco in 500 microlitri di Complete Growth Medium per ottenere una soluzione di lavoro farmacologica con una concentrazione finale di 120 nanomolari. Eseguire 5, due volte delusioni seriali come indicato nel protocollo. Diluire allo stesso modo il farmaco più soluzioni di anibodies monoclonali. Per arrivare alla concentrazione finale, trasferire 50 microlitri di ciascuna soluzione farmacologica nei pozzi corrispondenti, come mostrato in questo layout sperimentale. Incubare le cellule per 72 ore nell'incubatrice. Aggiungere 10 microlitri di soluzione di reagente MTT in ogni pozzo. Incubare a 37 gradi Celsius per 4 ore. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di licina in ogni pozzo utilizzando una pipetta multicanale e mescolare accuratamente mediante pipettazione. Incubare a 37 gradi Celsius per 4 ore in una camera umidificata. Liberare gli assorbenti a 570 e 620 nanometri usando uno spettrofotometro. Calcolare la vitalità della cella come segue. Calcolare i valori interessati dalla frazione utilizzando la seguente equazione. Eseguire il software di simulazione, fare clic sul nuovo pulsante esperimento per ottenere la finestra principale. Digitare il nome dell'esperimento. Fare clic su nuovo singolo farmaco. Digitare il nome. Digitare l'abbreviazione. Digitare l'unità di concentrazione del farmaco. Immettere i dati 1 dose e valore fa. Premere INVIO.Ripetere questo passaggio finché non vengono immessi tutti i punti dati. Fate clic su Finito (Finished).Seguire gli stessi passaggi per immettere i punti dati degli anticorpi monoclonali. Fare clic su Nuova combinazione di farmaci.Selezionare anticorpi farmacologici e monoclonali. Selezionate Rapporto costante (Constant Ratio).Fate clic su OK. Digitare il nome. Digitare l'abbreviazione. Digitare il rapporto anticorpo monoclonale del farmaco. Immettere i dati 1 dose. Premere INVIO.Il programma calcolerà automaticamente le dosi di Anticorpo Monoclonale 8B6 e combo. Immettere i dati 1 valore dell'a.ti.Premere INVIO.Ripetere questo passaggio finché non vengono immessi tutti i punti dati. Fare clic su Finito.Quindi, fare clic su Genera report.Selezionare il farmaco e l'anticorpo monoclonale, quindi fare clic su OK. Selezionare Combo e quindi FARE CLIC SU OK. Selezionare Intestazione, Tabella CI e Tabella riepilogativo e quindi fare clic su OK. Digitare il nome del file e l'analisi e fare clic su Salva per generare il report. Il report si apre automaticamente nel browser Web predefinito. Il report contiene una sezione della tabella di riepilogo che include i parametri titolo, data, nome finale, nota di descrizione, m, Dm e r, dose efficace 50 per l'agente utilizzato come monoterapia o in combinazione e la tabella dell'indice combinato per ogni combinazione alla dose effettiva 50, 75, 90 e 95.Un valore dell'indice combinato minore di 1 indica sinergismo. Un valore uguale a uno indica additività. Un valore maggiore di 1 indica antagonismo. Scongelare la matrice della membrana basale durante la notte immergendo il flaconcino nel ghiaccio in frigorifero a 4 gradi C prima dell'uso. Tutta l'usura della coltura o i supporti che vengono a contatto con la metrica della membrana basale devono essere prechilliti. Raccogli la cultura IMR5. Trasferire le celle in un tubo conico da 15 ml e centrifugare a 300 g per 5 minuti. Scartare il supernatante. Lavare le celle con PBS ghiacciato da 15 mL due volte. Preparare una sospensione cellulare per 5 milioni di cellule per mL in PBS ghiacciato. Trasferire la sospensione cellulare in un microtubo da 1,5 mL. Flaconcino a matrice di membrana basale girevole. Aggiungere 1 volume del reagente a matrice di membrana basale, miscelato mediante pipettazione per ottenere la sospensione cellulare di 2,5 milioni di celle per mL.Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio. Radere il fianco di dove verrà eseguita l'iniezione. Mescolare le cellule e disegnare con cura la sospensione cellulare in una siringa da 1 ml montata con un ago da 21 g. Verificare che non vi siano bolle d'aria nella siringa. Disinfettare l'area di inoculazione dei topi con una soluzione antisettica. Spremere delicatamente la pelle del mouse sul fianco tra le dita nel sito di iniezione. Inserire l'ago esattamente nella piega della pelle. Non posizionare l'ago in profondità nel tessuto per assicurare l'iniezione sottocutanea. Iniettare sottocutaneamente 100 microlitri di sospensione cellulare IMR5. Ruotare la siringa per evitare la diffusione del liquido e ritirare l'ago. Monitorare i topi per il peso corporeo e la crescita del tumore. Misurare la lunghezza e la larghezza del tumore con un calibro. Calcola il volume tumorale usando questa formula. Inizia la terapia quando i tumori hanno raggiunto un volume medio da 50 a 60 mm
