A imunoterapia combinada com a quimioterapia representa uma abordagem inovadora para desenvolver uma terapia eficiente no câncer. Os principais objetivos são alcançar efeitos sinérgicos, terapêuticos, redução de dose e toxicidade, e minimizar ou retardar a indução da resistência medicamentosa. No entanto, por razões práticas e éticas, não é possível determinar o sinergismo nos pacientes. Assim, antes da combinação direta em ensaios clínicos, estudos de combinação de prenicaptores, in vitro e/ou em animais, devem ser realizados para obter a lógica para estudos clínicos. Um método simples e robusto para a quantificação do sinergismo entre as drogas baseia-se na equação de índice de combinação desenvolvida por Shouan Talale, como ilustrado neste vídeo. Usando este método, e sua simulação computadorizada, evidenciamos aqui o sinergismo entre o Anticorpo Monoclonal 8B6, que é específico para o antígeno de neuroblastoma O-Acetyl-GD2 Ganglioside e a droga quimioterápica Topotecan em células neuroblastoma. Resumidamente, após determinar a dose efetiva de 50 valores de cada composto em IMO humana, 5 linha celular neuroblastoma, essas células foram entubadas com razões equitagens dos dois compostos, e os valores do índice de combinação foram calculados por meio de simulação computador automatizada. Em seguida, confirmamos esses resultados na Vivo, em um modelo IMO, 5 tumores xenografados. Nós cultivamos células IMR-5 em um frasco T75, observamos-nas sob um microscópio, para verificar a confluência celular. Asperate meio celular do frasco, lave com 5 mL de PBS. Adicione 3 mL de solução 0,05%EDTA/PBS. Devolva o frasco à incubadora por 3 minutos. Examine a cultura celular sob um microscópio para desprendimento celular. Adicione 10 mL de meio celular completo ao frasco e transfira a suspensão da célula para um tubo cônico estéril de 15 mL. Centrífuga por cinco minutos a 300 g.Conte células usando um hemócito. Remova e descarte o supernaspe. Re suspender células em Meio de Crescimento Completo.Ajuste o volume médio para obter concentração final de 100.000 células/mL.Semente 84 poços, 96 placas de cultura bem com 10.000 células cada, que é 100 microliters de suspensão celular. Incubar células por 18 horas na Incubadora celular.Diluir anticorpo monoclonal em 500 microliters de Meio de Crescimento Completo para obter uma solução de trabalho de anticorpos com uma concentração de anticorpos monoclonais 240 micro-gramas por mL.Execute 5 delírios serial duas vezes, conforme indicado no protocolo. Diluir a droga em 500 microliters de Complete Growth Medium para obter uma solução de trabalho medicamentosa com uma concentração final de 120 nanomolar. Realize 5, duas vezes delírios seriais, como indicado no protocolo. Diluir da mesma forma que a droga mais soluções de anibodies monoclonais. Para chegar à concentração final, transfira 50 microliters de cada solução de medicamentos nos poços correspondentes, como mostrado neste layout experimental. Incubar as células por 72 horas na incubadora. Adicione 10 microliters de solução de reagente MTT em cada poço. Incubar a 37 graus Celsius por 4 horas. Adicione 100 microliters de solução lycine em cada poço usando uma pipeta multicanal e misture bem por pipetação. Incubar a 37 graus Celsius por 4 horas em uma câmara umidificada. Livre os absorventes a 570 e 620 nanômetros usando um espectrômetro. Calcule a viabilidade celular da seguinte forma. Calcule os valores afetados pela fração usando a seguinte equação. Execute o software de simulação, clique no novo botão de experimento para obter a janela principal. Digite o nome do experimento. Clique em nova droga única. Digite o nome. Digite a abreviação. Digite a unidade de concentração de drogas. Digite dados 1 dose e valor fa. Pressione Enter.Repita esta etapa até que todos os pontos de dados sejam inseridos. Clique em Concluído.Siga os mesmos passos para inserir os pontos de dados de anticorpos monoclonais. Clique em New Drug Combo.Select droga e anticorpos monoclonais. Selecione Relação constante.clique em OK. Digite o nome. Digite a abreviação. Digite a relação de anticorpos monoclonais da droga. Digite a dose 1 dos dados. Pressione Enter.O programa calculará automaticamente as doses de Anticorpo Monoclonal 8B6 e combo. Digite o valor de FA dos dados 1.Pressione Enter.Repita esta etapa até que todos os pontos de dados sejam inseridos. Clique em Concluído.Em seguida, clique em Gerar Relatório.Selecione a droga e o anticorpo monoclonal e, em seguida, clique em OK. Selecione Combo e clique em OK. Selecione Cabeçalho, Tabela CI e Tabela de Resumo e clique em OK. Digite o nome do arquivo e a análise e clique em salvar para gerar o relatório. O relatório é aberto automaticamente no navegador padrão da Web. O relatório contém uma seção de tabela de resumo que inclui título, data, nome final, nota de descrição, m, Dm e r parâmetros, dose efetiva 50 para qualquer agente usado como monoterapia ou em combinação, e a tabela de índice de combinação para cada combinação na dose efetiva 50, 75, 90 e 95.Um valor de índice de combinação menor que 1 indica sinergismo. Um valor igual a um indica aditividade. Um valor maior que 1 indica antagonismo. Descongele a matriz da membrana do porão durante a noite submergindo o frasco no gelo em 4 graus C geladeira antes do uso. Todo o desgaste da cultura, ou mídia que entra em contato com a métrica da membrana do porão deve ser prechilled. Colher a cultura IMR5. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL e centrífuga a 300 g por 5 minutos. Descarte o supernaspeso. Lave as células com 15 mL de pbs gelado duas vezes. Prepare uma suspensão celular para 5 milhões de células por mL em PBS gelado. Transfira a suspensão do celular para um microtubo de 1,5 mL. Frasco de matriz de membrana do porão giratório. Adicione 1 volume do reagente da matriz da membrana do porão, misturado por pipetação para obter suspensão celular de 2,5 milhões de células por mL.Mantenha a suspensão celular no gelo. Raspe o flanco de onde a injeção será feita. Misture as células e desenhe cuidadosamente a suspensão celular em uma seringa de 1 mL montada com uma agulha de 21 g. Verifique se não há bolhas de ar na seringa. Desinfetar a área de inoculação dos camundongos com uma solução antisséptica. Aperte suavemente a pele do rato no flanco entre os dedos no local da injeção. Insira a agulha exatamente na dobra cutânea. Não coloque a agulha profundamente no tecido para assegurar a injeção subcutânea. Injete 100 microliters de suspensão celular IMR5 subcutânea. Gire a seringa para evitar a propagação líquida e retire a agulha. Monitore os camundongos para o peso corporal e o crescimento do tumor. Meça o comprimento e largura do tumor com um calibre. Calcule o volume do tumor usando esta fórmula. Terapia inicial quando os tumores atingiram um volume médio de 50 a 60 mm
