Il test di sinergia manuale dell'array di scacchiera è un metodo ad alta intensità di lavoro e soggetto a errori. Al contrario, il nostro metodo di scacchiera automatizzato basato su stampante a getto d'inchiostro migliora notevolmente la velocità, la precisione e la velocità effettiva. Il metodo di scacchiera automatizzato consente di migliorare un gran numero di farmaci per combinazioni sinergiche, mentre il metodo time-kill può confermare ed esplorare ulteriormente l'attività di queste combinazioni.
La scoperta di nuovi antibiotici non è al passo con la diffusione della resistenza, ma lo studio delle combinazioni sinergiche offre la possibilità di recuperare i farmaci esistenti per trattare i batteri resistenti. Sebbene dimostriamo questa tecnica con antibatterici, potrebbe anche essere utilizzata con altre classi di antimicrobici o anche per diversi tipi di farmaci combinati o test composti. In questo video, dimostriamo un metodo di array di scacchiera automatizzato e un metodo di uccisione manuale del tempo.
Suggeriamo di eseguire prima studi sugli array di scacchiera per identificare combinazioni promettenti, quindi indagarle ulteriormente con studi di uccisione del tempo. Per iniziare, creare soluzioni antimicrobiche stock di colistina e minociclina, quindi eseguire il controllo di qualità sulle soluzioni stock come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Aggiungere quindi circa un millilitro di cloruro di sodio allo 0,9%, salino, a tubi di coltura del vetro rotondi da 12 millimetri per 75 millimetri.
Selezionare una o due colonie da una piastra di batteri durante la notte e posizionarle nei tubi di coltura. Vortice i tubi delicatamente per sospendere i batteri nella soluzione. Controllare la concentrazione di batteri utilizzando un lettore McFarland.
Regolare la concentrazione aggiungendo più saline o più batteri per ottenere una lettura della torbidità di 0,5 McFarland. Quindi, diluire i batteri uno a 300 aggiungendo 100 microlitri della sospensione a 30 millilitri di brodo Mueller-Hinton regolato dal catione in un tubo conico da 50 millilitri per raggiungere una densità cellulare finale di cinque volte 10 alla quinta unità di formazione della colonia per millilitro. Ora, prepara gli antimicrobici per la stampa seguendo il protocollo di testo di accompagnamento.
Salvare il protocollo e quindi fare clic sul pulsante Esegui in alto a sinistra, seguito dal pulsante Start. Caricare una piastra da 384 po' nel supporto della piastra e premere Caricato sotto il prompt Synergy della piastra di carico 1. Quindi, inserire una cassetta T8+ nello slot della cassetta e premere Caricato sotto il prompt Carica t8+cassetta.
Quando richiesto, aggiungere la soluzione di stock antibiotico ai serbatoi indicati sulla cassetta. Dopo aver aggiunto ogni soluzione, premere il pulsante Riempito. Una volta che il distributore D300 ha aggiunto scorte di antibiotici in volumi appropriati a ciascun pozzo e viene visualizzata la casella Esegui completato, fare clic su Chiudi, rimuovere la piastra e spegnere il D300.
Quindi, versare la sospensione batterica precedentemente preparata in un serbatoio di reagente sterile. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 microlitri della sospensione a tutti i pozzi dell'array di scacchiera. Quindi, aggiungere 50 microlitri di brodo Mueller-Hinton regolato dal catione senza batteri a un pozzo vuoto.
Questo sarà il controllo negativo bene per confermare la sterilità dei media. Incubare in un incubatore di aria ambiente Celsius di 35 gradi per 16-20 ore. Per analizzare il test, seguire il protocollo di testo di accompagnamento.
Per il test di sinergia time-kill, preparare nuovamente le soluzioni stock antimicrobiche come descritto nel protocollo di testo. Quindi, effettuare una sospensione di 0,5 McFarland dell'organismo di prova in soluzione salina sterile. Aggiungere 100 microlitri della sospensione McFarland da 0,5 a cinque millilitri di CAMHB in un tubo di coltura del fondo rotondo in vetro da 25 per 150 millimetri con chiusura in acciaio inossidabile e vortice delicatamente da mescolare.
Utilizzando un anello inoculato sterile, striature di isolamento una goccia della sospensione diluita su una piastra di agar del sangue e incubare la piastra a 35 gradi Celsius nell'aria ambiente per confermare la purezza dell'inoculo. Sostituire la chiusura sul tubo e incubarla in un rack della provetta su uno shaker a 35 gradi Celsius nell'aria ambiente per almeno 3 ore, fino a raggiungere la crescita in fase logaritmica. Mentre la coltura iniziale è in incubazione, aggiungere 10 millilitri di brodo Mueller-Hinton regolato dal catione a cinque tubi di coltura del vetro autoclavato.
Per uno studio di sinergia time-kill, almeno un farmaco dovrebbe essere a una concentrazione che non influisce individualmente sulla curva di crescita. Questo può essere determinato valutando gli effetti delle singole concentrazioni di farmaci prima dello studio sinergico. Al primo tubo, aggiungere 10 microlitri di un milligrammo per millilitro di celenina per ottenere una concentrazione finale di colistina di un microgrammo per millilitro, poiché si tratta di una concentrazione inefficace contro il ceppo utilizzato in questo esempio.
Per il secondo tubo, aggiungere 10 microlitri di un milligrammo per millilitro di minociclina per ottenere una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro. Questa concentrazione è anche inefficace contro il ceppo utilizzato in questo esempio. Al terzo tubo aggiungere 10 microlitri di calcio di minociclina da un milligrammo per millilitro e 10 microlitri di celenina da un milligrammo per millilitro.
Questa è la stessa quantità di colistina e minociclina utilizzata nei tubi uno e due. Nel quarto e nel quinto tubi, non aggiungere antibiotici. Questo sarà rispettivamente il controllo della crescita e i tubi di controllo negativi.
Successivamente, preparare 96 piastre in polipropilene a pozzo profondo con pozzetti da due millilitri per diluizioni seriali aggiungendo 900 microlitri di soluzione salina sterile alle file da B a H di colonne da uno a quattro con pipetta multicanale. Quando la coltura è in fase di crescita logaritmica, rimuovere il tubo di coltura dallo shaker e vortice delicatamente. Trasferire un millilitro della sospensione in un tubo di coltura del vetro da 12 per 75 millimetri e controllare la densità con un lettore McFarland.
Se la densità è inferiore a 1,0 McFarland, riportare il tubo allo shaker e incubare più a lungo. Se è maggiore di 1,0 McFarland, aggiungere il brodo Mueller-Hinton regolato dal catione al tubo, il vortice delicatamente e ricampare fino a quando la sospensione è a 1,0 McFarland. È importante che la cultura sia nella fase di crescita logaritmica quando si prepara l'inoculo iniziale.
È possibile costruire una curva di crescita per determinare quando un organismo raggiunge questa fase. Quindi, aggiungere 100 microlitri della sospensione 1.0 McFarland ai tubi da uno a quattro e vortice delicatamente. Immediatamente dopo la miscelazione e in una, due, quattro, sei e 24 ore, rimuovere un'aliquota di 150 microliter da ogni tubo di coltura inclinando il tubo in modo che solo la punta sterile della pipetta entri nel tubo e non nell'albero del pipettor non sterile durante il prelievo dell'aliquota.
Aggiungere aliquote, rispettivamente, a pozzi consecutivi nella prima fila della piastra a pozzo profondo 96 precedentemente preparata. Riportare i tubi su un rack della provetta su uno shaker in un incubatore di aria ambiente Celsius di 35 gradi immediatamente dopo aver rimosso le aliquote in ogni punto di tempo. Utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere 100 microlitri dalla riga A della piastra e aggiungerla alla riga B, contenente 900 microlitri di soluzione salina, creando una diluizione uno-a-10.
Pipettare la soluzione su e giù da quattro a cinque volte per mescolare, quindi scartare le punte. In primo luogo, etichettare le piastre di agar Mueller-Hinton con le condizioni antibiotiche e la diluizione da placcare. Quindi, placcare i campioni diluiti per il conteggio delle colonie utilizzando il metodo della piastra di caduta, utilizzando una pipetta multicanale con punte extra-lunghe.
Rimuovere 10 microlitri da ogni pozzo nella prima colonna e distribuire con cura in fila sulla piastra opportunamente etichettata. Continuare fino a quando tutte le file non vengono erose sulle piastre. Inoltre, nel momento di 24 ore, posizionare una goccia di 10 microliter prelevata direttamente dal tubo di controllo negativo sul punto dedicato a questo al fine di testare la sterilità.
Quindi, invertire tutte le piastre e incubarle durante la notte a 35 gradi Celsius nell'aria ambiente. Quindi, contare il numero di colonie su ogni area e calcolare la densità cellulare. Contrassegnare le colonie con un pennarello permanente a punta fine sul retro della piastra per evitare il doppio conteggio o le colonie mancanti.
Per ogni serie di diluizione, identifica le gocce da tre a 30 colonie. Conta le colonie in queste gocce e registra il conteggio insieme al fattore di diluizione. Qui è mostrata una griglia di un esperimento sinergico checkerboard array in cui la minociclina in concentrazioni da zero a 32 microgrammi per millilitro è stata combinata con colinina a concentrazioni da zero a 16 microgrammi per millilitro e testata contro un ceppo di E.coli.
I pozzi con valori OD600 inferiori a 07 non rappresentano crescita e sono ombreggiati di rosso, mentre i pozzi con valori OD600 superiori o uguali a 07 rappresentano la crescita e sono ombreggiati di verde. Per ogni farmaco, la concentrazione inibitoria minima è la più bassa concentrazione di farmaco che inibisce la crescita batterica. Per la minociclina, si tratta di 32 microgrammi per millilitro, e per la colistina, è di otto microgrammi per millilitro.
L'ombreggiatura viene mantenuta qui, ma i valori all'interno dei pozzi in cui la crescita è inibita sono sostituiti da valori di indice inibitori frazionari, o FIC. In ogni pozzo, l'indice FIC di ogni farmaco viene calcolato dividendo la concentrazione di antibiotico in quel pozzo per la concentrazione inibitoria minima del farmaco. I pozzi con un indice FIC inferiore o uguale a 0,5, che è considerato il cutoff per la sinergia, sono indicati con un bordo a linea rotta e il pozzo con l'indice FIC più basso è in grassetto.
Poiché il valore FIC minimo è nell'intervallo sinergico, la combinazione è considerata sinergica. Un esempio di un caso che non dimostra sinergia è mostrato qui, come l'indice FIC minimo in cui la crescita è inibita è uno, che è maggiore di 0,5. Infine, in questo esempio, si sono verificati diversi pozzi saltati, che rappresentano una crescita batterica che è inibita, nonostante la presenza di crescita batterica in pozzi adiacenti con concentrazioni più elevate di antibiotico.
Se più di un pozzo saltato si è verificato in una matrice di scacchiera, i risultati devono essere scartati e il test ripetuto. Qui viene presentato un esempio di grafico che dimostra i risultati di un saggio di sinergia time-kill. Si prega di consultare il protocollo di testo di accompagnamento per i dettagli sull'interpretazione del saggio di sinergia time-kill.
Ulteriori informazioni sull'attività delle combinazioni sinergiche possono essere ottenute attraverso valutazioni della farmacocinetica e della farmacodinamica e attraverso studi in vivo con modelli animali. Seguire sempre le procedure di sicurezza appropriate, incluso l'uso di dispositivi di protezione individuale, quando si lavora con i batteri. Se si generano aerosol o si utilizzano agenti patogeni ad alto rischio, eseguire tutto il lavoro in un armadio di biosicurezza.
