I dispositivi microfluidici utilizzati per compartimentare i neuroni sono diventati uno strumento standard nelle neuroscienze, consentendo ai ricercatori di manipolare fisicamente e chimicamente le regioni subcellulari dei neuroni tra cui somata, assoni, dendriti e sinapsi. Questi dispositivi di coltura compartimentati possono aiutare a rispondere a numerose domande nel campo delle neuroscienze, come, come gli assoni si estendono durante lo sviluppo per formare sinapsi, come le sinapsi rimodellano e si riformano a seguito dei danni all'assone e come le condizioni patologiche possono propagarsi transsinapticamente in malattie come l'Alzheimer. Questo protocollo descrive l'uso di chip multicompartment di plastica preassemblati per compartimentare i neuroni del ratto primario della coltura compartimentale.
Il vantaggio principale dell'uso di questi chip è che forniscono un metodo facile da usare e altamente riproducibile per compartimentare i neuroni. Un altro vantaggio è che questi chip producono una crescita più sana e a lungo termine di neuroni e assoni isolati rispetto ai precedenti dispositivi compartimentati a base di silicio e sono ugualmente compatibili con la microscopia ad alta risoluzione. Altri sistemi modello, incluse le cellule staminali umane, possono anche essere coltivati all'interno del chip di compartimentazione preassemblato.
Per iniziare, posizionare un chip sterile multicompartmento in una piastra di Petri. Aggiungere 100 microlitri di una soluzione di precodifica al pozzo in alto a sinistra del chip e consentirgli di fluire attraverso il canale principale nel pozzo adiacente. Quindi, riempire il pozzo in basso a sinistra del chip con 100 microlitri della soluzione di precodifica.
Questa volta, attendere cinque minuti per consentire alla soluzione di fluire attraverso le micro-scanalature. Ora, aggiungere 100 microlitri della soluzione di precodifica al pozzo in alto a destra e consentirgli di fluire attraverso il canale principale nel pozzo adiacente. Dopo 90 secondi, riempire bene in basso a destra con 100 microlitri della soluzione di precodifica e incubare il chip per 10 minuti.
Inclinare con cura la punta della pipetta, lontano dal canale principale e aspirare la soluzione da ogni pozzo. Quindi, aggiungere immediatamente 150 microlitri di PBS all'angolo in alto a sinistra e attendere un minuto e mezzo. Successivamente, aggiungere 150 microlitri di PBS al pozzo in basso a sinistra e attendere cinque minuti per consentire al liquido di fluire attraverso le micro-scanalature.
Quindi, aggiungere 150 microlitri di PBS ai pozzi in alto a destra e in basso a destra, in questo ordine. Dopo 10 minuti, aspirare nuovamente il PBS e ripetere i passaggi di lavaggio una seconda volta. Dopo il secondo lavaggio, aspirare il PBS dai pozzi come prima pescando la punta della pipetta, lontano dall'apertura del canale.
Quindi, aggiungere 100 microlitri di 0,5 mix per mil soluzione di poli-D-lisina, al pozzo in alto a sinistra del chip. Attendere un minuto e mezzo e quindi riempire bene la parte inferiore sinistra con 100 microlitri della soluzione di poli-D-lisina. Ripetere questo processo sulla metà destra del chip.
Chiudi la piastra di Petri. Quindi, posizionare il chip in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo l'incubazione, sciacquare il chip due volte con PBS come descritto in precedenza.
Quindi, aspirare il PBS dal dispositivo. Immediatamente, aggiungere 100 microlitri di mezzi di coltura cellulare al pozzo in alto a sinistra del chip. Dopo un minuto e mezzo, aggiungere bene i supporti in basso a sinistra.
Attendere cinque minuti per consentire ai supporti di fluire attraverso le micro-scanalature e quindi ripetere il processo di riempimento sul lato destro del chip. Preparare una sospensione cellulare dei neuroni ippocampali del ratto dissociati secondo protocolli stabiliti. Rimuovere la maggior parte dei supporti in ogni pozzo del chip, ma lasciare i canali riempiti.
Successivamente, caricare immediatamente cinque microlitri della sospensione cellulare nel pozzo in alto a destra e altri cinque microlitri di sospensione cellulare nel pozzo in basso a destra. Quando si caricano le celle, puntare la punta della pipetta verso il canale principale. Dopo aver caricato le cellule, trasferire il chip in uno stadio di microscopio e assicurarsi che i neuroni si trovano nel canale principale.
Dopo aver aspettato cinque minuti che le cellule si attaccano, aggiungere circa 150 microlitri di mezzi di coltura neuronale a ciascuno dei pozzi superiore e inferiore destro. Quindi, aggiungere 150 microlitri di supporti a ciascuno dei pozzi superiore e inferiore sinistro. Coprire la piastra di Petri e posizionare il truciolo in un vassoio umidificato in un'incubatrice del 5%, 37 gradi Celsius.
In primo luogo, rimuovere 20 microlitri dal pozzo in basso a sinistra del compartimento assonale e posizionarlo nel pozzo superiore destro del compartimento somatico. Attendere due minuti affinché il flusso all'interno di ogni canale equilibra. Successivamente, rimuovere 50 microlitri di supporti dal compartimento assonale e aggiungere 0,3 microlitri di un idrazide Alexa Fluor 488 millimolare a questo supporto.
Pipettare su e giù per mescolare la soluzione e quindi restituire il supporto contenente il colorante fluorescente nel compartimento assonale. A questo punto, posizionare il chip sul microscopio e sull'immagine come desiderato. Per eseguire l'assotomia all'interno del chip, in primo luogo, rimuovere il supporto dal compartimento assonale, tenendo la punta della pipetta lontana dall'ingresso del canale principale.
Conservare il supporto rimosso in un tubo di centrifuga per ora. Quindi, posizionare la pipetta di aspirazione vicino, sia l'ingresso del canale principale del compartimento assonale che aspirare completamente il compartimento assonale. Continuare ad aspirare l'area per uno o due minuti.
Sostituire il compartimento assonale con il supporto memorizzato. Assicurarsi che la soluzione sia completamente rimossa dal compartimento e che gli assoni siano recisi guardando il campione al microscopio. Quindi, coprire il chip e restituirlo all'incubatore.
Per iniziare l'immunosocienza a fluorescenza, rimuovere la maggior parte del supporto dal chip, mantenendo i compartimenti interni idratati. Immediatamente, aggiungere 100 microlitri di soluzione di fissaggio ai pozzi superiore dei compartimenti assonali e somatici. Dopo un minuto, aggiungere 100 microlitri di soluzione di fissaggio ai pozzi inferiori e fissare le celle per 30 minuti a temperatura ambiente.
Rimuovere la maggior parte della soluzione dai pozzi e, immediatamente, aggiungere 150 microlitri di PBS a ciascuno dei pozzali superiore dei compartimenti assonali e somatici. Attendere due minuti affinché il PBS fluisse nei pozzali inferiori, quindi rimuovere il PBS e risciacquare i pozzali altre due volte utilizzando lo stesso processo. Dopo l'ultimo risciacquo, rimuovere la maggior parte del PBS dai pozzali del chip e aggiungere immediatamente 150 microlitri di PBS con 0,25%tritone x-100 a ciascuno dei pozzali superiore dei compartimenti assonali e somatici.
Attendere 15 minuti e quindi rimuovere la maggior parte del liquido dai pozzi. Aggiungere immediatamente 150 microlitri di soluzione di blocco a ciascuno dei pozzali superiore dei compartimenti assonali e somatici. Dopo 15 minuti, rimuovere la maggior parte del liquido dai pozzi e, immediatamente, aggiungere 100 microlitri della soluzione anticorpale primaria, a ciascuno dei pozzi superiore dei compartimenti assonale e somatico.
Coprire il chip per ridurre al minimo l'evaporazione e incubare le cellule nell'anticorpo primario per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, sciacquare il chip rimuovendo la maggior parte della soluzione e aggiungendo immediatamente 150 microlitri di PBS a ciascuno dei pozzi superiore dei compartimenti assonali ematici. Dopo cinque minuti, rimuovere il PBS da entrambi i pozzali e ripetere il risciacquo altre due volte.
Ora, rimuovere la maggior parte del liquido dai pozzi e, immediatamente, aggiungere 100 microlitri di anticorpi secondari in PBS, a ciascuno dei pozzi superiori dei compartimenti assonali e somatici. Coprire il chip per ridurre al minimo l'evaporazione e incubare il truciolo per un'ora a temperatura ambiente. Come mostrato in precedenza, sciacquare il chip tre volte con PBS, quindi montare e imageare i chip come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento.
Mostrato qui, è un confronto fianco a fianco dei neuroni coltivati su chip di plastica e dispositivi PDMS. La crescita neuronale è paragonabile all'interno delle due piattaforme fino a 15 giorni di coltura, ma a età di coltura più lunghe, gli assoni isolati all'interno del chip di plastica, appaiono più sani con meno battiti. Per visualizzare ulteriormente gli assoni all'interno dei compartimenti assonali, questi campioni sono stati immunososteniati anche per la beta tubulina III, che mostra una sana crescita assonale all'interno dei trucioli di plastica a 22 giorni di coltura.
Un'ulteriore colorazione con campioni di 24 giorni mostra neuroni cresciuti nei chip di plastica per esprimere sia i marcatori sinaptici eccitatori che inibitori, vGlut1 e vGat. Ecco i due marcatori sinaptici combinati con neuroni mCherry retrogradi etichettati. Per dimostrare l'idoneità di questo chip per gli studi sulla lesione dell'assone e sulla rigenerazione, i neuroni retrogradi etichettati sono stati imageati prima e 24 ore dopo l'assotomia.
Un bulbo di retrazione e un assone rigenerante sono entrambi evidenti dopo l'assotomia. Questi risultati sono equivalenti ai dati pubblicati utilizzando dispositivi basati su PDMS. I classici chip multicompartment forniscono un'opzione facile da usare per compartimentare i neuroni fornendo colture neuronali a lungo termine, che rimangono vitali per più di tre settimane.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di seminare un numero appropriato di neuroni e assicurarsi che l'incubatore sia ben umidificato durante la coltura.
