I mitocondri sono essenziali per la salute neuronale. In molte malattie neurodegenerative, i mitocondri assonali sono i primi a soffrire, ma non è chiaro cosa renda i mitocondri assonali così speciali. Il gradiente di pressione fluidica nelle camere utilizzate in questo protocollo consente il trattamento selettivo degli assoni dei mitocondri.
Questo lascia indisturbati i processi del corpo cellulare e ci permette di concentrarci sulla biologia assonale. Mostriamo qui la depolarizzazione dei mitocondri con un colorante sensibile al potenziale di membrana, ma questo metodo può essere applicato a molti diversi tipi di cellule neuronali e letture fluorescenti. Per iniziare, posizionare le sei piastre codificate in un cappuccio sterile e lavarle due volte con acqua distillata doppia sterile.
Lasciare asciugare le piastre in posizione inclinata per tre-cinque minuti. Rimuovere l'acqua in eccesso mediante aspirazione sottovuoto o pipettaggio. Quindi immergere la camera microfluidica in etanolo all'80%.
Anche in questo caso, asciugare la camera microfluidica per tre-cinque minuti in posizione inclinata e rimuovere l'etanolo in eccesso con una punta di pipetta. Una volta completamente asciutta, posizionare la camera microfluidica al centro del pozzetto e della piastra. Picchiettare delicatamente la camera microfluidica ai bordi e la sezione microsolco al centro per un corretto fissaggio alla lastra di vetro.
In primo luogo, raccogliere il numero desiderato di neuroni ippocampali dissociati in un tubo di reazione da 1,5 millilitri. Centrifugare il tubo a 1000 volte G per quattro minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in otto microlitri di mezzi neuro basali B-27.
Quindi erogare la soluzione cellulare nell'ingresso del canale della camera microfluidica. Toccare sul retro della piastra per facilitare il flusso attraverso il canale. Utilizzando una pipetta, aspirare eventuali sospensioni cellulari residue all'uscita del canale.
Incubare la camera microfluidica con cellule per 15-20 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quindi, riempire il pozzetto assonale superiore con 50 microlitri di mezzi neurobasali B-27 e toccare il retro della piastra per aiutare il flusso. Riempire ogni pozzetto sul lato soma con 150 microlitri di mezzi neurobasali B-27, creando una bolla di tensione sulla parte superiore.
Riempire anche entrambi i pozzetti del lato assonale con 100 microlitri di mezzi neurobasali B-27 ciascuno. Dopo sette-otto giorni di coltura in vitro, assicurarsi che gli assoni siano cresciuti attraverso i microsolchi e si siano estesi nel compartimento assonale. Lavare il dispositivo rimuovendo il mezzo neurobasale B-27 e aggiungendo 100 microlitri di mezzo di imaging preriscaldato ai pozzetti superiori di entrambi i canali assonale e soma.
Lascia che il mezzo fluisca attraverso i pozzi inferiori. Rimuovere il mezzo dai pozzetti inferiori e qualsiasi mezzo rimanente dai pozzetti superiori e ripetere con il terreno fresco, lasciando i pozzetti vuoti alla fine del lavaggio. Quindi aggiungere 100 microlitri di diluizione TMRE nanomolare sia al pozzetto somatico che a quello assonale.
Lascia che il mezzo scorra attraverso entrambi i compartimenti, fino a quando non c'è un volume uguale in tutti i pozzi. Riempire con il supporto contenente TMRE. Seleziona una regione di interesse nel compartimento somatico e seguila attraverso i microsolchi nel compartimento assonale.
Assicurarsi che le micro scanalature riprodotte nei compartimenti somatico e assonale siano abbinate tra loro. Dopo aver modificato il nome del file, acquisire immagini a fluorescenza rossa utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione di 561 nanometri e lunghezze d'onda di emissione di 625 nanometri. Garantire una differenza di volume tra le camere soma e assonale controllando la presenza di una bolla di tensione sul lato somatico.
Quindi rimuovere il mezzo di imaging da entrambi i pozzetti del lato assonale, ad eccezione del mezzo all'interno del canale. Per indurre la depolarizzazione mitocondriale, aggiungere 160 microlitri di 20 micromolari antimicina A diluiti nel mezzo di imaging al pozzetto assonale superiore. Lascia che fluisca attraverso il canale fino a quando non c'è un volume uguale in entrambi i pozzetti assonali.
Ripetere l'imaging, assicurandosi che vengano visualizzate le stesse posizioni di durante l'acquisizione della linea di base, identificando i microsolchi. Utilizzando questo protocollo, i neuroni ippocampali primari sono stati coltivati in dispositivi microfluidici, seguiti dalla colorazione mitocondriale con un colorante sensibile alla membrana, TMRE. La colorazione omogenea dei mitocondri è stata osservata su entrambi i lati dei microsolchi, ma non nel mezzo.
Dopo l'aggiunta di antimicina A al lato assonale, i mitocondri somali hanno mantenuto il segnale TMRE, mentre la fluorescenza è stata persa dai mitocondri assonali Assicurarsi che non rimanga umidità nel pozzetto o sul dispositivo prima di assemblare il dispositivo. In caso contrario, le camere non saranno sigillate. Usando questo metodo, possiamo studiare gli effetti della perdita della funzione mitocondriale nell'assone e nelle funzioni locali, nonché la sua influenza sulla segnalazione retrograda e sulla sopravvivenza cellulare globale.
Si è pensato a lungo che la biogenesi mitocondriale avvenisse esclusivamente nel corpo cellulare. Questo metodo ci ha permesso di rivelare che il danno mitocondriale assonale richiedeva la traduzione locale del corto di proteina PINK1.
