Questo metodo può aiutare con l'indagine di proteine di membrana come trasportatori e canali. Le informazioni sulla perdita di tasso di turnover del substrato confrontando l'attività e la specificità proteica e le diverse condizioni fisiologiche e patologiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che riduce al minimo le potenziali variazioni di spostamento e le condizioni di tampone libero dal cloruro.
E aumenta significativamente la precisione della determinazione del tasso di turnover grazie a misurazioni più esatte del potenziale della membrana. Raccogli gli elementi per i primi passi. Questi includono due punte di pipetta micro-capillare, una lama affilata e una pinza scorrevole.
Per l'elettrodo hanno filo d'argento, carta vetrata e una soluzione di cloruro di potassio molare a portata di mano. Inoltre hanno etanolo e acqua per la pulizia e un alimentatore CC. Procedere lavorando con le due punte di micro-pipetta.
Inizia con il suggerimento che conterrà il buffer. Posizionare il secondo suggerimento accanto al primo. Spostare la seconda punta, quindi, una volta inserita, la parte stretta si estenderà di almeno cinque millimetri nella parte stretta della prima.
Contrassegnare la posizione in cui verrà collegato il primo buffer contenente la punta. Quindi utilizzare la pinza per misurare la lunghezza dell'elettrodo a ponte di sale micro-agar. Utilizzare la lama per tagliare la punta alla lunghezza appropriata.
Pulire la superficie tagliata con etanolo seguito dall'acqua. Successivamente, ottenere una lunghezza di circa otto centimetri di filo d'argento per l'elettrodo. Pulire il filo su salviette con etanolo seguito da acqua.
Dopo la pulizia, utilizzare carta vetrata per levigare la superficie su una lunghezza di un centimetro ad un'estremità. Questo filo con la sua estremità levigata è pronto per essere rivestito elettrochimicamente. Mettere l'estremità levigata nella soluzione di cloruro di potassio con l'altra estremità collegata a un alimentatore CC per il rivestimento.
Quando è rivestito, scollegare l'elettrodo e pulirlo con acqua. Dopo l'asciugatura, determinare la lunghezza che gli consente di penetrare la punta del micro capillare nel modo più profondo possibile. Tagliare l'elettrodo dal lato non rivestito alla lunghezza appropriata.
Ora, vai avanti per preparare una soluzione di sale con agarosio. In un pallone contenente acqua sciogliere il cloruro di potassio e utilizzare un agitatore magnetico per aiutare la miscelazione. Dopo aver rimosso l'agitatore aggiungere l'agarosio al pallone.
Portare il pallone in un forno a microonde e scaldarlo per sciogliere l'agarosio a circa 100 gradi Celsius. Estorsi per controllare visivamente che l'agarosio sia completamente sciolto. Una volta che l'agarosio viene sciolto pipetta 10 microlitri nel micro-capillare lentamente per evitare bolle d'aria.
È importante pipettare con cura la soluzione di sale di agar nella punta micro capillare, specialmente ad alte concentrazioni di agar. Se non eseguita correttamente, le bolle d'aria sono facilmente prodotte nella punta e bloccano il flusso elettrico. Dopo aver rimosso la punta dalla pipetta spingere l'elettrodo in esso.
Assicurarsi che l'elettrodo penetri nella soluzione salina. Quando l'elettrodo è a temperatura ambiente, collegarlo a un elettrodo di riferimento in un amplificatore. Sostenere l'elettrodo di riferimento in modo che possa essere abbassato in un contenitore di plastica con un millilitro di tampone.
Quindi, immergere l'elettrodo del ponte di sale nella soluzione. Applicare una tensione e verificare che vi sia una risposta di corrente prima di continuare. Se il test ha esito positivo, scollegare gli elettrodi.
Se necessario, conservare l'elettrodo del ponte di sale immergerlo in una soluzione di cloruro di potassio molare. Quindi, preparare il tampone contenente la punta di plastica. Prendi una punta micro capillare e identifica un punto a due centimetri dalla parte stretta.
Utilizzare un filo riscaldante per piegare il tubo di 90 gradi in questa posizione. Con un coltello affilato tagliare il tubo a cinque millimetri dalla piega. Pulire l'area che è stata tagliata con etanolo seguita da acqua.
Prima di procedere, utilizzare un microscopio leggero con una scala per misurare il diametro del foro sulla punta. Quindi, spostare la pipetta per essere vicino a un contenitore di solvente e un altro di tampone. Pipettare tre microlitri del solvente in entrata e in uscita dalla punta.
Quindi, riempire la punta di misura con tre microlitri di tampone. Ora, recuperate il ponte di sale dalla soluzione di cloruro di potassio. Collegare la punta di misura con il tampone all'elettrodo del ponte di sale.
Collegare l'elettrodo del ponte di sale e l'elettrodo di riferimento a un amplificatore. A questo punto, sospendere l'elettrodo del ponte di sale nella soluzione tampone con l'elettrodo di riferimento. Una rappresentazione della configurazione per l'esperimento è in questo schema.
Durante l'esperimento, la membrana si formerà alla fine del tampone contenente pipetta. Raccogliere dati per trovare la capacità della membrana. Eseguire questa operazioni applicando un segnale triangolare a tensione alternata per creare una risposta rettangolare a corrente alternata.
Quindi, trovare la conduduanza e la tensione a corrente zero. Automatizzare l'applicazione di una rampa di tensione che va da meno 50 a 50 millivolt e registrare la corrente. Adattare una funzione lineare ai dati.
La pendenza è la conduttenza, l'intercetta x è la tensione a corrente zero. Al termine rimuovere la punta di misura dal ponte di sale. Riempire una nuova punta di misura con tampone, regolarla in base a un diverso valore di pH per impostare un gradiente di protone attraverso la membrana.
Ristabilire l'impianto sperimentale con una nuova punta di misura ed elettrodi per ripetere le misurazioni. Ecco registrazioni rappresentative della tensione di corrente in presenza di un gradiente di pH. E, in assenza di un gradiente di pH.
Le linee rappresentano un adattamento lineare ai dati. Lo spostamento nel punto di intersezione dell'asse x per i diversi valori di pH è previsto dall'equazione di Nernst. Questi dati rappresentano lo spostamento del potenziale di membrana nel tempo per un elettrodo standard di cloruro d'argento in bianco, e l'elettrodo a ponte di sale micro-agar in nero.
L'elettrodo a ponte di sale agar era più stabile con uno spostamento massimo inferiore a cinque millivolt in 300 secondi di misurazione. In questo grafico dello spostamento potenziale in funzione del gradiente di pH, i due elettrodi si comportano in modo significativamente diverso all'aumentare del gradiente di pH. Il tasso di turnover dei protoni può essere trovato e confrontato per i due tipi di elettrodi.
Ecco i numeri di ricambio dei protoni determinati per la proteina di disaccoppiamento mitocondriale un UCP1 misurato dall'elettrodo del ponte di sale rispetto a un elettrodo standard. Ci sono anche dati per UCP3 preparato in modo simile. Le velocità sembrano più precise con l'elettrodo a ponte di sale agar.
Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di assicurarsi che l'elettrodo penetri nella soluzione di sale di agar. Anche il ponte di sale deve immergersi nella soluzione tampone. Infine, assicurarsi che la soluzione di sale di agar non contenga bolle d'aria.
