Questo lavoro è supportato anche da finanziamenti Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e da morbo di Crohn e Colite Foundation of Canada (CCFC).

1. Modello murino di DSS-indotta colite acuta <ol><li> Aggiungi destrano sodio solfato (DSS) per l&#39;acqua potabile sterilizzati in autoclave per la concentrazione finale desiderata (1-5%) (peso / volume) (cioè per ottenere una soluzione DSS 5%, aggiungere 25 mg di polvere di DSS a 500 ml di acqua autoclavato) . Soluzione madre può essere lasciato a temperatura ambiente per un massimo di una settimana a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> In una cappa di biosicurezza, versare DSS soluzione madre in 50 ml provette Falcon (una necessaria per gabbia). Mantenere la soluzione stock di tubi ricarica quando necessario. </li><li> Sostituire l&#39;acqua potabile in ogni gabbia del mouse con la soluzione DSS (in provette Falcon da 50 ml) (La durata dipende dal regime DSS che viene utilizzato. Ad esempio, utilizzando 6-8 C57BL vecchio settimana maschio / 6 topi, abbiamo amministrare un DSS soluzione al 5% per un totale di cinque giorni). I topi non dovrebbero avere accesso a qualsiasi altra fonte d&#39;acqua. Topi di controllo sono forniti di acqua potabile senza autoclave DSS. </li><li> Pesare topi quotidiano e registrare la quantità di DSS consumata al giorno. Top ognibottiglia da 50 ml dopo la registrazione dei livelli DSS. Questo è quello di misurare il volume approssimativo di DSS consumata per gabbia del mouse per tutta la durata dell&#39;esperimento. Nei nostri studi, si usa una soluzione DSS 5% per 5 giorni con C57BL maschio / 6 topi. Significativa perdita di peso, la consistenza delle feci alterata e segni di sangue fecale sono visti fin dal giorno 3 utilizzando questo particolare regime DSS. Durante l&#39;amministrazione DSS, i topi mostrano notevole perdita di peso (circa 5-10% del loro peso iniziale il giorno 5) con la perdita di peso superiore al 20% del peso iniziale con disidratazione e diarrea essere l&#39;indicatore significativo fisiologico che un animale è pari o vicino endpoint. Se l&#39;animale abbia accesso ad acqua normale, dopo i 5 giorni del 5% di DSS, si recupererà entro 7 giorni. Tutti gli esperimenti devono essere approvati dalla dell&#39;istituzione animale comitato etico ed essere in conformità del protocollo approvato utilizzo degli animali (AUP). </li><li> Per tutta la durata dell&#39;esperimento, un indice di attività della malattia (DAI)punteggio può essere valutato per valutare la progressione clinica della colite. Il DAI è il punteggio combinato della perdita di peso rispetto al peso iniziale, la consistenza delle feci, e sanguinamento. I punteggi sono definiti come segue: perdita di peso: 0 (nessuna perdita), 1 (1-5%), 2 (5-10%), 3 (10-20%), e 4 (&gt; 20%), la consistenza delle feci: 0 (normale), 2 (feci molli), e 4 (diarrea), e sanguinamento: 0 (assenza di sangue), 1 (Hemoccult positivo), 2 (Hemoccult sanguinamento positivo e visivo pellet), e 4 (sanguinamento grave, il sangue intorno ano). DAI può essere segnato ogni giorno per tutta la durata del trattamento DSS. </li><li> Nel punto in tempo di scelta, peso e sacrificio topi. I topi possono essere eutanasia da dislocazione cervicale a seguito di inalazione di isoflurano o altro metodo riconosciuto da stabulario dell&#39;istituto. </li></ol> 2. Raccogliere campioni di tessuto del colon <ol><li> Esporre il lato ventrale dell&#39;animale e bagnare la zona addominale con una soluzione di etanolo al 70%. A questo punto, fare riferimento alla Tabella 1 e fare atto di unany segni di sanguinamento rettale (sangue presente al orifizio anale) o prolasso rettale in ogni animale. </li><li> Uso standard forbici dissezione di incidere l&#39;addome facendo una incisione ventrale linea mediana. </li><li> Individuare i due punti e transetto i due punti più vicino possibile al margine del colon-retto più possibile per liberare il colon distale. </li><li> Attentamente e lentamente tirare fuori tutto il colon, distogliendolo dalle mesentere circostante. </li><li> Transetto i due punti al margine colonocecal per liberare l&#39;estremità prossimale del colon. Feci può essere rimossa risciacquando colon con PBS sterile utilizzando un ago sonda collegata ad una siringa da 3 o 5 ml o da spremere accuratamente con l&#39;ausilio di un paio di pinzette piegato / pinze. Utilizzando l&#39;intero colon, per valutare i danni (vedi Sezione 3.1) </li><li> Campionamento per l&#39;analisi istologica dei tessuti ed altri test può essere fatto tagliando 0,5 centimetri per 1,0 centimetri lunghi frammenti del colon prendendo nota di quale area campione è di (cioè prossimale, medio o distale). </li><li> Campioni di tessutoda utilizzare per i test possono essere singolarmente posto in 1,5 ml provette Eppendorf e congelato in azoto liquido e conservati fino al momento dell&#39;uso a -70 ° C. </li></ol> 3. Valutazione della gravità colite <ol><li> Punteggio di gravità macroscopica o malattia terminale è valutata da un osservatore imparziale utilizzando un sistema di punteggio precedentemente pubblicato (Tabella 1). 9 La consistenza delle feci può essere valutata utilizzando una pinza e premendo verso il basso le feci per determinare la consistenza. Per determinare il punteggio di sangue nelle feci, si noti il ​​colore delle feci (feci cioè nero contro la luce feci marrone) e convalidare ulteriormente con un test Hemoccult. Utilizzando il sistema di punteggio, determinano un punteggio per ciascuna delle condizioni. Il punteggio finale macroscopico per ogni animale è la somma di ogni punteggio individuale. </li><li> Per valutare i danni istologici di gravità colite, tagliare un piccolo frammento (0,5 cm) del colon, posto in una cassetta tessuto e immergerlo in soluzione tamponata formalina al 10%. Preparare 5paraffina micron incorporato sezioni trasversali e sezioni macchia con ematossilina / eoxin (H &amp; E) utilizzando le procedure appropriate. Frammenti del colon può essere preso dal prossimale, a metà del colon, o parte distale del colon. </li><li> H &amp; E sezioni colorate di tessuto del colon sono segnati da un osservatore cieco utilizzando un sistema precedentemente pubblicato per le seguenti misure: architettura cripta (normale, 0 - grave distorsione cripta con perdita di cripte intero, 3), grado di infiltrazione di cellule infiammatorie (normale, 0 - denso infiltrato infiammatorio, 3), l&#39;ispessimento del muscolo (base della cripta si trova sulla muscolaris mucosae, 0 - segnata presenti ispessimento del muscolo, 3), deplezione delle cellule caliciformi (assente, 0 - oggi, 1) e ascesso cripta (assente, 0 - presente , 1). 7 Il punteggio danno istologico è la somma di ogni punteggio individuale. Va notato che a differenza dell&#39;uomo UC, ascessi cripta non sono caratteristici di questo modello e si vedono raramente; ulcerazioni microscopiche sono anche rari. Se le sezioni più due punti sono statimacchiato, punteggi tra sezioni istologiche simili dovrebbero essere usati per determinare il punteggio finale per ogni area (cioè punteggio istologico nel colon prossimale rispetto al punteggio istologico nel colon distale). </li></ol> 4. Preparare soluzioni di reagenti per le analisi <ol><li> Preparare una soluzione 50 mM di tampone fosfato di potassio con l&#39;aggiunta di soluzione B (K 2 HPO 4, 8,7 g di fosfato di potassio bibasico in 1 L di dH 2 O) per la soluzione A (KH 2 PO 4, 6,8 g di fosfato monobasico di potassio in 1L di dH 2 O) fino a pH di 6,0 è raggiunto. Le soluzioni rimanente può essere conservato in frigorifero (2-8 ° C) fino a un uso futuro. </li><li> Preparare bromuro esadeciltrimetilammonio (HTAB) tampone con l&#39;aggiunta di 5 g HTAB in 1 L di tampone fosfato di potassio (50 mM, pH = 6,0). Delicatamente il calore per sciogliere e conservare a 2-8 ° C fino al momento dell&#39;uso. Quando richiesto, il calore di ri-sciogliere. </li><li> Preparare tampone di lisi per la omogeneizzazione dei tessuti per l&#39;analisi delle proteine ​​da parteaggiungendo 10 mL di 1M tris-acido cloridrico (pH = 8,0), 6 ml di cloruro di sodio 5 M e 2 ml di Triton X-100-182 ml di acqua distillata sterilizzata. Triton X-100 è molto viscoso a temperatura ambiente e, quindi, dovrebbe essere riscaldato delicatamente prima dell&#39;uso. Il tampone di lisi preparata possono essere conservati a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 5. Preparazione dei campioni per le analisi <ol><li> La preparazione del campione per l&#39;analisi MPO. <ol><li> Rimuovere i campioni da -70 ° C e il luogo in ghiaccio. Registrare il peso di ciascun campione dopo aver rimosso le feci visibili o grasso utilizzando un pinza piegata / pinzetta e il luogo in 2 ml Eppendorf Safe-Lock provetta (o qualsiasi altro tubo che può essere utilizzato con un omogeneizzatore). I campioni devono essere conservati in ghiaccio in ogni momento. E &#39;importante notare che i frammenti del colon simili dovrebbero essere usati da ogni replica biologici (ad esempio sezioni sezioni distale o prossimale solo solo). </li><li> Aggiungi omogeneizzatore tallone ad ogni provetta. </li><li> Aggiungere la quantità appropriata di buf HTABFer in base al peso del tessuto. Se il peso del tessuto è inferiore a 25 mg, aggiungere la soluzione tampone con un rapporto di 12.5mg/mL, se il peso del tessuto è compresa tra 25-50, aggiungere con un rapporto di 25mg/ml. Se il peso del tessuto è superiore a 50, aggiungere tampone con un rapporto di 50mg/ml. </li><li> Omogeneizzare con un omogeneizzatore tessuto per 4 min a 30 Hz.. Ripetere se il tessuto non è completamente omogeneizzato. </li><li> Rimuovere omogeneizzatore tallone e la soluzione di centrifuga per 6 min (13.400, xga 4 ° C). </li><li> Raccogliere ed eliminare il surnatante risultante pellet. Supernatent possono essere conservati a -70 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> La preparazione del campione per l&#39;analisi delle citochine. <ol><li> Ripetere i passaggi 5.1.1. a 5.1.2. </li><li> Aggiungere 50 ml di cocktail di inibitori delle proteasi (PIC) a 10 mL di tampone di lisi preparata. </li><li> Aggiungere 1 ml del PIC e di soluzione tampone di lisi per ogni campione a prescindere dal peso. </li><li> Omogeneizzare per 5 min a 30 Hz.. Ripetere se il tessuto non è completamente omogeneizzato. </li><li> Rimuovere omogeneizzatore tallone e centrifugare SOLUZIOper 5 min a 3300 x g. </li><li> Raccogliere ed eliminare il surnatante risultante pellet. Surnatante può essere conservato a -70 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li></ol> 6. Quantificazione di marker infiammatori <ol><li> Attività di test MPO <ol><li> Preparare o-dianisidina dicloridrato (o-dianisidina) soluzione combinando 16,7 mg di o-dianisidina dicloridrato, 90 ml di dH 2 O e 10 ml di tampone fosfato di potassio. Questa soluzione deve essere preparato fresco per ogni test. </li><li> Aggiungere 7 ml di tessuto omogenato (preparato in paragrafo 5.1) in triplice copia in una piastra a 96 pozzetti. </li><li> Aggiungere 50 ml di diluito H 2 O 2 (4 ml di 30% di H 2 O 2 diluita in 96 ml di dH 2 O) per l&#39;o-dianisidina miscela. </li><li> Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 200 microlitri della o-dianisidina miscela contenente H 2 O 2 a ciascuno dei pozzi. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza a 450 nm usando uno spettrofotometrotometer. Prendere tre letture ad intervalli di 30 secondi. </li><li> Calcolare l&#39;attività MPO. Attività MPO è misurata in unità (U) di MPO / mg di tessuto, in cui è definito un&#39;unità di MPO come l&#39;importo necessario per degradare 1 mmol di H 2 O 2 al minuto a temperatura ambiente. Considerando che una sola unità (U) di MPO = 1 mol di H 2 O 2 diviso e che 1 mol di H 2 O 2 dà un cambiamento di assorbanza di 1,13 x 10 -2 nm / min, unità di MPO in ogni campione è determinato come variazione di assorbanza [ΔA (t 2-t 1)] / Δmin x (1,13 x 10 -2). Per ottenere unità per mg di tessuto, uso del tessuto: rapporto di buffer. Per esempio, se un tessuto: il rapporto di buffer di 50 mg / ml è stato usato, in 7 ml di omogenato, non vi è 0,35 mg di tessuto. Pertanto, per ottenere unità per mg di tessuto, dividere le unità di MPO da 0,35. Un esempio di calcolo utilizzando i valori di assorbanza (nm) è riportato qui di seguito (assumendo che il campione è stato aggiunto in triplice copia): </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Campione </td><td colspan="3"> Tempo 0 sec </td><td colspan="3"> Tempo di 30 sec </td><td colspan="3"> Tempo di 60 sec </td></tr><tr><td> A </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 1 &#39; </td><td> 2 &#39; </td><td> 3 &#39; </td><td> 1 &quot; </td><td> 2&#39;&#39; </td><td> 3 &quot; </td></tr><tr><td></td><td> 0,048 </td><td> 0,048 </td><td> 0,051 </td><td> 0,061 </td><td> 0,061 </td><td> 0,065 </td><td> 0,074 </td><td> 0,073 </td><td> 0,078 </td></tr></tbody></table><ol class="lroman"><li> Media al tempo 0 sec = (0,048 + 0,048 + 0,051) / 3 = 0,049 nm </li><li> Media in fase di 30 sec = 0,0623 nm </li><li> Media in fase di 60 sec = 0,075 nm </li><li> Variazione di assorbanza (ΔA) da 0 a 30 sec / mg di tessuto (assumendo 50 mg / ml di tessuto: rapporto di buffer) = [(0,0623-0,049) / (1,13 x 10 -2)] / 0,35 = 3,363 </li><li> Cambiamento di assorbireANCE (ΔA) da 30 a 60 sec / mg di tessuto = 3,211 </li><li> * Attività di MPO (U / mg di tessuto) = media di ΔA (0-30) e ΔA (30-60) = 3,287 </li></ol><ol start="2"><li> Quantificazione dei citochine pro-infiammatorie da ELISA <ol><li> Citochine (IL-1β, IL-6 e TNF-α) i livelli sono determinati utilizzando disponibili in commercio enzyme-linked test immunoenzimatico (ELISA) Kit (Quantikine murini; R &amp; D Systems). </li><li> Valori di assorbanza di ogni ELISA è normalizzata usando un test proteina Bradford rispettivi ad ogni campione e viene espresso in unità di pg / mg di proteina. </li></ol></li></ol> 7. Rappresentante Risultati Amministrazione del regime DSS appropriato indurre colite acuta nei topi. Durante la durata del trattamento DSS, DAI possono essere utilizzati per valutare e valutare la progressione clinica della malattia. Gli animali trattati con DSS mostrerà significativa perdita di peso rispetto al loro peso iniziale, perdita di feci e fecisanguinamento (Figura 1). Sul sacrificio e l&#39;esame del colon, la gravità della colite è macroscopicamente punteggio sulla base di un accorciamento della lunghezza del colon, sanguinamento intestinale, sanguinamento nelle feci, perdita di consistenza delle feci, e segni di sanguinamento rettale, rispetto ai controlli trattati con sola acqua (Figura 2 e Tabella 1). Le sezioni trasversali dei campioni di tessuto del colon colorate con H &amp; E avrà punteggi più alti istologici per DSS trattati con i due punti contro l&#39;acqua trattata controlli (Figura 3). Per caratterizzare ulteriormente il grado di infiammazione nei topi trattati con DSS, attività MPO può essere valutata da omogeneizzato campioni di tessuto del colon. DSS trattati con i due punti che hanno una maggiore attività MPO rispetto ai controlli (Figura 4). Inoltre, questo è associato ad aumento dei livelli di citochine pro-infiammatorie (IL-1β, IL-6, TNF-α) (Figura 5). <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig1.jpg" /><br/&gt; Figura 1. Maschio, topi C57BL / 6 è stata data al 5% DSS nel bere acqua per 5 giorni. DAI punteggi sono stati valutati al giorno per ogni animale e sono stati in media al giorno per ciascun gruppo (media ± SEM, n = 4 topi / gruppo). <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig2.jpg" /> Figura 2. Topi C57BL / 6 è stata data al 5% DSS in acqua potabile per 5 giorni. Topi di controllo hanno ricevuto acqua senza DSS. Macroscopico danno punteggio / malattia punteggi di gravità sono stati valutati alla cieca il giorno 5 dopo DSS-indotta colite. I due punti isolati da topi che avevano ricevuto DSS hanno punteggi più elevati danni macroscopici (sanguinamento rettale, prolasso rettale, diarrea, sanguinamento del colon) che indica una maggiore gravità della malattia (media ± SEM, n = 4 topi / gruppo). <img src="/files/ftp_upload/3678/3678fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Topi C57BL / 6 è stata data soluzione DSS 5% in acqua potabile al fine di indurre colite. Topi di controllo<html> ricevuto acqua senza DSS. (A) i punteggi istologici sono stati ciecamente valutato con H &amp; E sezioni colorate di tessuto del colon raccolto il 5 ° giorno post-DSS amministrazione. (B), DSS-campioni trattati mostrano più danni istologici (infiltrazione di più cellulari, più deplezione delle cellule caliciformi, maggiore distorsione / danni alla cripta architettura) rispetto a (C) controlli (media ± SEM, n = 4 topi / gruppo). In (B) e (C), asterisco (*) indica un&#39;area di deplezione delle cellule caliciformi e la distorsione di architettura cripta; cancelletto (#) indica infiltrazione cellulare. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig4.jpg" /> Figura 4. Tutti i topi sono stati sacrificati il giorno 5 l&#39;amministrazione postale di DSS e campioni di tessuto del colon sono stati raccolti per valutare l&#39;attività MPO. La gravità della colite indotta da DSS è associata a più alti livelli di attività MPO rispetto ai controlli (media ± SEM, n = 4 topi / gruppo). _upload/3678/3678fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Oltre ai livelli più alti MPO, la gravità della colite indotta da DSS è anche associata ad un aumento del livello di pro-infiammazione citochine come IL-1β, IL-6, TNF-α (media ± SEM, n = 4 topi / gruppo). <table border="1"><tbody><tr><td> Punteggio </td><td> Sanguinamento rettale </td><td> Prolasso rettale </td><td> Sgabello Coerenza </td><td> Sangue </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Nessuno </td><td> Nessuno </td><td> Normale </td><td> Normale </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Rosso </td><td> I segni di prolasso </td><td> Morbido </td><td> Rosso </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Rosso Scuro </td><td> Prolasso chiaro </td><td> Molto morbido </td><td> Rosso scuro </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Lordo Bleeding </td><td> Prolasso ampia </td><td> Diarrea </td><td> Nero </td></tr></tbody></t&gt; in grado Tabella 1. Macroscopica punteggio di gravità / Malattia

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A., Ridwan, B. W., McGhee, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hapten-induced+model+of+murine+inflammatory+bowel+disease:+mucosa+immune+responses+and+protection+by+tolerance.">Hapten-induced model of murine inflammatory bowel disease: mucosa immune responses and protection by tolerance.</a> J. Immunol. 157, 2174-2185 (1996).</li><li>Dieleman, L. A., Ridwan, B. U., Tennyson, G. S., Beagley, K. W., Bucy, R. P., Elson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium-induced+colitis+occurs+in+severe+combined+immunodeficient+mice.">Dextran sulfate sodium-induced colitis occurs in severe combined immunodeficient mice.</a> Gastroenterology. 107, 1643-1652 (1994).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

DSS colite è un modello ampiamente utilizzato indotto chimicamente di infiammazione intestinale. In questo modello, i topi sono fornite di acqua potabile integrato con DSS, che è pensato per essere tossico per le cellule epiteliali intestinali e danneggiare l&#39;integrità della barriera mucosale. 10 La somministrazione di DSS induce una colite acuta, che è caratterizzata da feci molli, sanguinamento fecale, e infiltrazione con granulociti. DSS 10 Durante l&#39;amministrazione, la colite è di ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / apparecchiatura: </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Eppendorf Safe-Lock provetta (2 ml) </td><td> eppendorf </td><td> 0030 120.094 </td><td></td></tr><tr><td> Biotek EL808 Assorbanza lettore di piastre </td><td> Biotek </td><td> EL808 </td><td></td></tr><tr><td> Destrano solfato di sodio per reagenti sale (peso molecolare 36,000-50,000 Da) </td><td> MP Biomedicals </td><td> 160110 </td><td></td></tr><tr><td> Gen 5 (software) </td><td> Biotek </td><td> Versione 1.10.8 </td><td></td></tr><tr><td> Esadeciltrimetilammonio bromuro (HTAB) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H5882-100G </td><td></td></tr><tr><td> Perossido di idrogeno, il 30 wt.% Soluzione in acqua </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 216763 </td><td> Conservare a 2-8 ° C </td></tr><tr><td> Microtest plmangiava da 96 pozzetti fondo piatto </td><td> Sarstedt </td><td> 82,1581 </td><td> Da utilizzare una sola </td></tr><tr><td> o-dianisidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-3252 </td><td> Sensibile alla luce. Conservare a 2-8 ° C </td></tr><tr><td> Fosfato di potassio dibasico </td><td> Caledon </td><td> 6620-1 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato di potassio, monobasico </td><td> EMD chimici </td><td> PX1565-1 </td><td></td></tr><tr><td> Inibitori della proteasi cocktail </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8340 </td><td> Conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tungsteno perline in metallo duro per Tissue Lyser II </td><td> QUIAGEN </td><td> 69997 </td><td></td></tr></tbody></table>

investigating intestinal inflammation in dss-induced model of ibd

La malattia infiammatoria intestinale (IBD) comprende una vasta gamma di patologie intestinali, le più comuni delle quali sono la colite ulcerosa (UC) e la malattia di Crohn (CD). Entrambe le UC e CD, quando presenti nel colon, generare un profilo simile sintomo che può comprendere diarrea, sanguinamento rettale, dolore addominale e perdita di peso. 1 Sebbene la patogenesi della malattia infiammatoria intestinale rimane sconosciuta, è descritto come una malattia multifattoriale che coinvolge sia componenti genetiche e ambientali 2. Ci sono modelli animali numerosi e variabili di infiammazione del colon che assomigliano a diverse caratteristiche di IBD. Modelli animali di colite gamma da quelli che nascono spontaneamente in ceppi sensibili di alcune specie a quelli che richiedono la somministrazione di concentrazioni specifiche di colite che inducono prodotti chimici, come il sodio destrano solfato (DSS). Chimica indotta modelli di infiammazione dell&#39;intestino sono i modelli più comunemente utilizzati e meglio descritta di IBD. ADMINIdimostrazione di DSS in acqua potabile produce colite acuta o cronica a seconda del protocollo di amministrazione 3. Animali dato DSS perdita di peso e mostrano segni di feci molli o diarrea, a volte con evidenza di sanguinamento rettale. 4,5 Qui si descrivono le modalità con cui sviluppo colite e la risposta infiammatoria risultante può essere definita dopo la somministrazione di DSS. Questi metodi includono l&#39;analisi istologica di ematossilina / eosina sezioni del colon macchiato, la misurazione di citochine pro-infiammatorie, e la determinazione della mieloperossidasi (MPO) attività, che può essere utilizzato come marker surrogato di infiammazione 6. L&#39;entità della risposta infiammatoria in stato di malattia può essere valutata la presenza di sintomi clinici o alterazioni istologiche nel tessuto della mucosa. Colon danno istologico viene valutata utilizzando un sistema di punteggio che considera la perdita di architettura cripta, infiltrazione di cellule infiammatorie, muscolari tascesso hickening, deplezione delle cellule caliciformi, e la cripta. 7 Quantitativamente, i livelli di citochine pro-infiammatorie acute con proprietà antinfiammatorie, come l&#39;interleuchina (IL)-1β, IL-6 e fattore di necrosi tumorale (TNF)-α, si può determinare con ELISA metodi convenzionali. Inoltre, l&#39;attività MPO può essere misurata mediante un saggio colorimetrico e utilizzato come un indice di infiammazione 8. Nella colite sperimentale, la gravità della malattia è spesso correlato con un aumento dell&#39;attività MPO e più elevati livelli di citochine pro-infiammatorie. Gravità colite e l&#39;infiammazione associati danno può essere valutata esaminando la consistenza delle feci e sanguinamento, oltre a valutare lo stato istopatologici dell&#39;intestino con ematossilina / eosina sezioni colorate di tessuto del colon. Frammenti di tessuto del colon può essere utilizzato per determinare l&#39;attività MPO e produzione di citochine. Nel loro insieme, queste misure possono essere utilizzate per valutare la risposta infiammatoria intestinalemodelli animali di colite sperimentale.

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Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD

Modelli sperimentali di malattia infiammatoria intestinale, ci hanno permesso di esaminare il complesso di risposte innate e adattative immunitario associate con patogenesi. Utilizzando il punteggio istologico, la quantificazione di citochine pro-infiammatorie e di attività mieloperossidasi, si può cominciare a valutare queste risposte visto nella malattia infiammatoria intestinale.

Indagare infiammazione intestinale in DSS-indotta Modello di IBD

Inflammatory bowel disease (IBD) encompasses a range of intestinal pathologies, the most common of which are ulcerative colitis (UC) and Crohn's Disease ...

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Research

JoVE Journal

Biology

66.7K Views.  McMaster University. Modelli sperimentali di malattia infiammatoria intestinale, ci hanno permesso di esaminare il complesso di risposte innate e adattative immunitario associate con patogenesi. Utilizzando il punteggio istologico, la quantificazione di citochine pro-infiammatorie e di attività mieloperossidasi, si può cominciare a valutare queste risposte visto nella malattia infiammatoria intestinale.

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Catheterization of Intestinal Loops in Ruminants

The intestine is a complex structure that is involved not only in absorption of nutrients, but also acts as a barrier between the individual and the outside world. As such, the intestine plays a pivotal role in immunosurveillance and protection from enteric pathogens. Investigating intestinal physiology and immunology commonly employs 'intestinal loops' as an experimental model. The majority of these loop models are non-recovery surgical procedures that study short-term (&lt;24 hr) changes in the intestine (1-3). We previously created a recovery intestinal loop model to specifically measure long-term (&lt;6 mo) immunological changes in the intestine of sheep following exposure to vaccines, adjuvants, and viruses (4). This procedure localized treatments to a specific 'loop', allowing us to sample this area of the intestine. A significant drawback of this method is the single window of opportunity to administer treatments (i.e. at the time of surgery). Furthermore, samples of both the intestinal mucosa and luminal contents can only be taken at the termination of the project. Other salient limitations of the above model are that the surgical manipulation and requisite post-operative measures (e.g. administration of antibiotics and analgesics) can directly affect the treatment itself and/or alter immune function, thereby confounding results. Therefore, we modified our intestinal loop model by inserting long-term catheters into the loops. Sheep recover fully from the procedure, and are unaffected by the exteriorized catheters. Notably, the establishment of catheters in loops allows us to introduce multiple treatments over an extended interval, following recovery from surgery and clearance of drugs administered during surgery and the post-operative period.

We describe a novel surgical method for catheterizing 'intestinal loops' within the ileum of sheep. Once animals have recovered from surgery and have cleared antibiotics and analgesics, multiple treatments can be deposited directly in loops via the catheters.

Cateterismo delle anse intestinali nei ruminanti

The intestine is a complex structure that is involved not only in absorption of nutrients, but also acts as a barrier between the individual and the ...

Ricerca

Biologia

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Rat Esteriorizzazione mesentere: un modello per indagare le dinamiche cellulari coinvolti nell&#39;angiogenesi

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including tumorous growths. However, the cellular remodeling mechanisms involved in, and caused by, intestinal obstructions are poorly understood. Several animal models of intestinal obstructions have been developed, but the mouse model is the most cost/time effective. The mouse model uses the surgical implantation of an intestinal partial obstruction (PO) that has a high mortality rate if it is not performed correctly. In addition, mice receiving PO surgery fail to develop hypertrophy if an appropriate blockade is not used or not properly placed. Here, we describe a detailed protocol for PO surgery which produces reliable and reproducible intestinal obstructions with a very low mortality rate. This protocol utilizes a surgically placed silicone ring that surrounds the ileum which partially blocks digestive movement in the small intestine. The partial blockage makes the intestine become dilated due to the halt of digestive movement. The dilation of the intestine induces smooth muscle hypertrophy on the oral side of the ring that progressively develops over 2 weeks until it causes death. The surgical PO mouse model offers an in vivo model of hypertrophic intestinal tissue useful for studying pathological changes of intestinal cells including smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC), PDGFR&#945;+, and neuronal cells during the development of intestinal obstruction.

Intestinal obstructions are a partial or complete blockage of the intestine that can cause severe abdominal pain, nausea, vomiting, and preventing the passage of stool. This procedure for creating intestinal partial obsructions in mice is reliable in studying the mechanisms underlying pathological cell growth and death in the intestine.

Un modello murino di ostruzione intestinale parziale

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

Analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del CENP-A con tag EYFP (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

Monostrato epiteliale derivato da organoidi: un modello in vitro clinicamente rilevante per la funzione di barriera intestinale

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the active proliferation of intestinal stem cells located at the bottom of intestinal crypts. However, during events of acute intestinal injury, these active intestinal stem cells undergo cell death. Gamma irradiation is a widely used colorectal cancer treatment, which, while therapeutically efficacious, has the side effect of depleting the active stem cell pool. Indeed, patients frequently experience gastrointestinal radiation syndrome while undergoing radiotherapy, in part due to active stem cell depletion. The loss of active intestinal stem cells in intestinal crypts activates a pool of typically quiescent reserve intestinal stem cells and induces dedifferentiation of secretory and enterocyte precursor cells. If not for these cells, the intestinal epithelium would lack the ability to recover from radiotherapy and other such major tissue insults. New advances in lineage-tracing technologies allow tracking of the activation, differentiation, and migration of cells during regeneration and have been successfully employed for studying this in the gut. This study aims to depict a method for the analysis of cells within the mouse intestinal epithelium following radiation injury.

The gastrointestinal tract is one of the most sensitive organs to injury upon radiotherapeutic cancer treatments. It is simultaneously an organ system with one of the highest regenerative capacities following such insults. The presented protocol describes an efficient method to study the regenerative capacity of the intestinal epithelium.

Rigenerazione epiteliale intestinale in risposta all'irradiazione ionizzante

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Effetti epiteliali dell'infiammazione intestinale sui colonoidi murini stabiliti

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic cell layer provides the first line of defense between microbial and immune populations and helps to modulate the intestinal immune response. Disruption of the epithelial barrier is a hallmark of inflammatory bowel disease (IBD) and is of interest for therapeutic targeting. The 3-dimensional colonoid culture system is an extremely useful in vitro model for studying intestinal stem cell dynamics and epithelial cell physiology in IBD pathogenesis. Ideally, establishing colonoids from the inflamed epithelial tissue of animals would be most beneficial in assessing the genetic and molecular influences on disease. However, we have shown that in vivo epithelial changes are not necessarily retained in colonoids established from mice with acute inflammation. To address this limitation, we have developed a protocol to treat colonoids with a cocktail of inflammatory mediators that are typically elevated during IBD. While this system can be applied ubiquitously to various culture conditions, this protocol emphasizes treatment on both differentiated colonoids and 2-dimensional monolayers derived from established colonoids. In a traditional culture setting, colonoids are enriched with intestinal stem cells, providing an ideal environment to study the stem cell niche. However, this system does not allow for an analysis of the features of intestinal physiology, such as barrier function. Further, traditional colonoids do not offer the opportunity to study the cellular response of terminally differentiated epithelial cells to proinflammatory stimuli. The methods presented here provide an alternative experimental framework to address these limitations. The 2-dimensional monolayer culture system also offers an opportunity for therapeutic drug screening ex vivo. This polarized layer of cells can be treated with inflammatory mediators on the basal side of the cell and concomitantly with putative therapeutics apically to determine their utility in IBD treatment.

Autore in primo piano: Studio degli effetti epiteliali dell'infiammazione intestinale in vitro su colonoidi murini consolidati  

We describe a protocol detailing the isolation of murine colonic crypts for the development of 3-dimensional colonoids. The established colonoids can then be terminally differentiated to reflect the cellular composition of the host epithelium prior to receiving an inflammatory challenge or being directed to establish an epithelial monolayer.

Studiare gli effetti epiteliali dell'infiammazione intestinale in vitro su colonoidi murini accertati

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...