Utilizzando i test qui presentati, la differenza nel fenotipo tra i ceppi di rotavirus può essere valutata, dove ceppi unici sono isolati. In particolare, viene studiato il cambiamento fenotipico dei ceppi di rotavirus resistenti ai disinfettanti. Per ottenere risultati quantitativi chiari utilizzando il saggio della placca, è fondamentale selezionare una combinazione appropriata di ceppo di rotavirus e siero, in cui il rotavirus è ben adattato al siero.
A dimostrare la procedura sarà Syun-suke Kadoya, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Rimuovere un CryoTube contenente linee cellulari MA104 dal contenitore di azoto liquido. Posiziona CryoTube in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per scongelare le cellule.
Aggiungere un millilitro della sospensione cellulare a 20 millilitri del mezzo contenente siero in un pallone T75. Incubare il pallone in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per due o tre giorni. Una volta che il monostrato cellulare raggiunge l'80% di confluenza, rimuovere il supernatante e lavare le cellule due volte con cinque millilitri del PBS di 1X Dulbecco.
Aggiungere quattro millilitri dello 0,05% di tripside-EDTA al pallone e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti per staccare le cellule dal pallone. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 190 g per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule pelletate in un millilitro di mezzo contenente siero.
Quindi diluire le cellule rimorsidenti 100 volte con il mezzo. Aggiungere tre millilitri della sospensione cellulare diluita ad ogni pozzo di una piastra a sei porri per il test della placca. Aggiungere un millilitro della sospensione cellulare diluita ad ogni pozzo di una piastra da 24 pozzetto per il saggio di legame cellulare.
Incubare le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5%CO2 vapore sottosaturo per due o tre giorni. Trasferire un tubo contenente un millilitro della sospensione del virus in mezzo privo di siero dallo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius a un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per scongelare. Aggiungere un microgrammo per microlitro di tripside dal pancreas suino a un millilitro della sospensione del virus e quindi del vortice.
Incubare la sospensione del virus a 37 gradi Celsius e 5%CO2 vapore sottosaturo per 30 minuti. Diluire la sospensione del virus attivata con mezzo privo di siero per regolare la molteplicità dell'infezione, o MOI, a 0,1 pfu per cellula. Aggiungere un millilitro della sospensione del virus diluito alle cellule MA104 in un pallone T75 tre giorni dopo la placcatura cellulare.
Incubare le cellule con virus a 37 gradi Celsius per un'ora, scuotendo delicatamente il pallone ogni 15 minuti. Quindi aggiungere 30 millilitri di un mezzo privo di siero contenente quattro microgrammi per millilitro di tripside dal pancreas suino al pallone. Incubare il pallone a 37 gradi Celsius e 5%CO2 vapore sottosaturo.
Raccogliere un millilitro del supernatante nel pallone a zero, sei, 12, 18, 24 e 36 ore dopo l'infezione e sostituire il supernatante nei tipi da 1,5 millilitri usando una pipetta. Condurre un ciclo di congelamento-disgelo entro 15 minuti a meno 80 gradi Celsius seguito da uno scioglimento di 15 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Quindi centrifugare i tubi a 12.600 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Raccogli il supernatante. Filtrare il supernatante con un filtro distillato da 0,2 micron per rimuovere la frazione cellulare. Conservare il supernatante a meno 80 gradi Celsius fino ad applicarlo al test della placca per misurare il titolo del virus.
Quando è pronto per eseguire il test della placca, posizionare i tubi contenenti il supernatante raccolto in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Aggiungere la tripsiderina a un millilitro di campione diluito 10 volte e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Durante questa incubazione di 30 minuti, lavare accuratamente le cellule MA104 in una piastra a sei pompoli con due millilitri di 1X PBS dopo aver rimosso il mezzo contenente siero.
Diluire serialmente i campioni incubati con mezzo privo di siero e inoculare un millilitro del campione diluito in ogni pozzo. Incubare la piastra per 90 minuti a 37 gradi Celsius e 5%CO2 vapore sottosaturo, scuotendo delicatamente la piastra ogni 15 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere l'inoculo dalla piastra a sei pozzi.
Aggiungere quattro microgrammi per millilitro di triptina al mezzo preparato. Aggiungere delicatamente ma immediatamente tre millilitri del mezzo mescolati con gel di agarosio ad ogni bene. Lasciare solidificare il gel di agarosio a temperatura ambiente per più di 10 minuti.
Quindi incubare la piastra per due giorni a 37 gradi Celsius e 5%CO2 vapore sottosaturo. Aggiungere quindi un millilitro di soluzione 0.015%Neutral Red diluita con 1X PBS a ciascun pozzo e incubare con le stesse condizioni. Rimuovere il colorante dopo tre ore e continuare a incubare per un giorno.
Il giorno dopo, contare il numero di placche in ogni pozzo e calcolare il pfu per millilitro. Controllare attentamente la confluenza cellulare prima del saggio della placca per assicurare i numeri della placca. Per il saggio di legame cellulare, aggiungere un microgrammo per microlitro di tripside da un pancreas suino a un millilitro della sospensione del virus, quindi vortice.
Diluire la sospensione del virus con un mezzo privo di siero per regolare il MOI a un pfu per cellula. Lavare le cellule MA104 due volte in una piastra da 24 pozzetti con un millilitro di soluzione salina tris-tamponata. Ora inoculare le cellule con 100 microlitri di sospensione del virus diluito in ogni pozzo della piastra da 24 pozzi.
Incubare il piatto a quattro gradi Celsius per 90 minuti con tremori delicati ogni 15 minuti. Rimuovere l'inoculo del virus e lavare le cellule due volte con un millilitro di soluzione salina tris-tamponata. Per estrarre l'RNA a doppio filamento del rotavirus, aggiungere 140 microlitri di 1X PBS e 560 microlitri del buffer di estrazione dell'RNA a ciascun pozzo.
Mescolare adeguatamente con una pipetta fino a quando non si vede la foschia delle cellule nel tampone. Dopo aver recuperato l'RNA a doppio filamento, secondo il protocollo del produttore, posizionare i tubi da 1,5 millilitri, contenenti l'estratto di RNA a doppio filamento, su un blocco termico a 95 gradi Celsius per cinque minuti per denaturare l'RNA. Quindi posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio e incubare per più di due minuti.
Sintetizzare il cDNA utilizzando un kit di trascrizione inversa. Aggiungere quattro microlitri di soluzione di RNA virale denaturato a un tubo PCR contenente 16 microlitri di miscela di reazione e mescolarlo con attenzione con una pipetta in modo da non generare bolle. Dopo aver filato i tubi, eseguire la trascrizione inversa con un termociclo.
Per la PCR quantitativa, utilizzare una sonda di inserimento quencher destinata alla regione da 963 a 1.049 del segmento del genoma NSP3 del rotavirus. Diluire serialmente il plasmide standard con acqua di grado PCR e procedere a creare il master mix per pcr quantitativo. Aggiungere 20 microlitri del master mix ai pozzi di una piastra PCR da 96 porri.
Quindi mescolare cinque microlitri di campioni di cDNA o cinque microlitri del plasmide standard pipettando 10 volte. Eseguire la PCR quantitativa in base alle condizioni del protocollo di testo. Infine, calcolare il genoma del rotavirus legato alla superficie cellulare ma104 come descritto nel protocollo di testo.
Qui è mostrata una curva di crescita del rotavirus. Applicando il metodo meno quadrato a un modello di Gompertz modificato, il tasso di crescita specifico è stimato a 0,197 e il periodo di ritardo è stimato a 6,61 ore. Il formicolio relativo del virus nella fase stazionaria al formicolio iniziale è 3.15.
Dei sei cloni di rotavirus testati, i valori stimati del tasso di crescita specifico variavano da 0,19 a 0,27. Questi valori stimati sono affidabili perché il coefficiente dei valori di determinazione nel raccordo del modello è superiore a 0,98. Il risultato del saggio di legame cellulare è mostrato come efficienza di legame, che è il rapporto tra particelle virali legate e quelle presenti nell'inoculo.
I nostri virioni RV che si legano alle superfici cellulari sono di circa 10.000 copie per millilitro con un'efficienza di rilegatura di circa l'1% quando si utilizza una piastra da 24 pozzetti per il saggio di legatura cellulare. Poiché le cellule coltivate sono sensibili agli stress fisici, fare attenzione a versare delicatamente ma rapidamente il tampone e l'agar. In sostanza, è stato introdotto un nuovo sistema per i virus.
Utilizzando questo sistema, possiamo valutare la reale capacità di legame cellulare e il tasso di crescita specifico con gli strumenti. Il nostro protocollo è vantaggioso per misurare il tratto fenotipico. Controllando diversi ceppi appena emergenti, puoi aiutare a valutare i suoi nuovi vaccini per i virus.
I virus sono designati come agenti patogeni BSL-2, quindi sarà necessario preparare sale sperimentali BSL-2 per eseguire questa procedura.
