Questo protocollo descrive un sistema di genetica inversa affidabile ed efficiente per la realizzazione di rotavirus ricombinanti. Spiega anche come realizzare rotavirus ricombinanti che esprimono proteine marcatori fluorescenti. Questo metodo è semplice che richiede un numero minimo di plasmidi e può generare rotavirus ricombinanti che esprimono proteine fluorurate separate e anche proteine virali.
Inizia seminando cellule BHKT7 su piastre da 12 pozzi. Risciacquare un monostrato di cellule appena confluente con PBS. Quindi interrompere il monostrato con soluzione di tripsiderina-EDTA e rimostrare le cellule in cinque millilitri di mezzo completo GMEM.
Determinare la concentrazione di cellule BHKT7 vitali utilizzando il blu tripano e un contatore di celle automatizzato. Quindi seminare due volte 10 alla quinta cella in un millilitro di GMEM in ogni pozzo di una piastra di coltura cellulare da 12 pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica del 5% durante la notte.
Il giorno successivo, preparare la miscela plasmide per la trasfezione secondo le indicazioni manoscritte. Quindi aggiungere 110 microlitri di mezzo siero ridotto pre-riscaldato a ogni miscela plasmide e pipettare delicatamente su e giù per mescolare. Aggiungere 32 microlitri di reagente di trasfezione alla miscela.
Fare una breve centrifugazione dopo il vortice e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Nel frattempo, sciacquare le cellule BHKT7 con due millilitri di mezzo incompleto GMEM. Aggiungere un millilitro di mezzo incompleto SMEM ad ogni pozzo e restituire la piastra all'incubatore.
Dopo l'incubazione di 20 minuti, utilizzare un pipettor da 200 microliter per aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia ad ogni pozzo. Scuotere delicatamente la piastra e restituirla all'incubatrice. Due giorni dopo la trasfezione, sciacquare un monostrato appena confluente di cellule MA104 con PBS.
Interrompere il monostrato con la soluzione di tripsiderina-EDTA e rimostrare le cellule in cinque millilitri di mezzo completo DMEM. Contare le cellule e regolare la concentrazione a otto volte 10 alla quinta colonna per millilitro di mezzo incompleto DMEM. Aggiungere 0,25 millilitri di cellule MA104 a goccia ai pozzi con le cellule BHKT7 trasfette.
Regolare la concentrazione di tripside a 0,5 microgrammi per millilitro aggiungendo 0,8 microlitri a un milligrammo per millilitro soluzione di tripina in ogni pozzo. Diluire le restanti cellule MA104 a una concentrazione di 1,5 per 10 alla quinta colonna per millilitro nel mezzo completo DMEM e posizionare due millilitri in ogni pozzo di una piastra a sei pozzetti. Sei giorni dopo la trasfezione, recuperare il virus ricombinante dalle cellule trasfette.
Sottopose le cellule BHKT7 MA104 a tre cicli di congelamento/disgelo in condizioni sterili, spostando le piastre tra un congelatore negativo di 20 gradi Celsius e la temperatura ambiente. Trasferire i lire in tubi da 1,5 millilitri. Centrifugare i tubi per 10 minuti a 500 volte g e quattro gradi Celsius per pellettare i detriti cellulari.
Raccogli il supernatante e conservalo a quattro gradi Celsius. Aggiungere la tripsidena a 100 microlitri di lisato cellulare chiarificato a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro e incubare la miscela a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi preparare una serie di diluizione seriale di 10 volte che va da 10 a quella negativa a 10 al sette negativo nel mezzo incompleto DMEM.
Risciacquare i monostrati MA104 due volte con due millilitri di PBS e una volta con mezzo incompleto DMEM. Aggiungere 400 microlitri di diluizioni di lisato in duplicato alle piastre e incubarli a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, dondolando ogni 10-15 minuti per ridistribuire le diluizioni attraverso il monostrato. Preparare una soluzione di sovrapposizione MEM di agarosio combinando volumi uguali di EMEM 2X prerifampto con agarosio fuso e raffreddato all'1,5%.
Mantenere questa soluzione a 42 gradi Celsius in un bagno d'acqua e regolare la concentrazione di tripside a 0,5 microgrammi per millilitro immediatamente prima di posizionarla sulle cellule. Aspirare le diluizioni del llysato dalla piastra a sei potte. Quindi sciacquare le cellule una volta con due millilitri di mezzo incompleto.
Aggiungere delicatamente tre millilitri della soluzione di sovrapposizione MEM di agarosio sul monostrato cellulare in ogni pozzo. Lasciare indurire l'agarosio a temperatura ambiente. Quindi riportare le piastre all'incubatrice.
Tre giorni dopo, preparare una soluzione di sovrapposizione MEM di agarosio come descritto in precedenza e aggiungere rosso neutro a una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro immediatamente prima dell'uso. Aggiungere due millilitri della soluzione di sovrapposizione sopra l'agarosio esistente nelle piastre a sei potte. Lasciare indurire l'agarosio e riportare la piastra nell'incubatrice, assicurandosi di proteggere le piastre con il rosso neutro dalla luce.
Nelle prossime sei ore, identificare le placche di rotavirus con l'aiuto di una scatola di luce. Utilizzare pipette di trasferimento usa e getta per raccogliere placche chiaramente definite, recuperando tappi di agarosio che si estendono completamente allo strato cellulare. Espellere la spina in un tubo da 1,5 millilitri contenente 0,5 millilitri di mezzo incompleto DMEM e vortice il campione per 30 secondi.
Amplificare il virus isolato della placca eluitato nel mezzo propagazione su monostrati MA104 o pallone AT25 con mezzo incompleto DMEM e 0,5 microgrammi per millilitro di tripina. Aggiungere 600 microlitri di lysati cellulari infetti chiarificati e 400 microlitri di tiocianato di guanidinio in tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Vortice per 30 secondi e incubarli a temperatura ambiente per cinque minuti.
Quindi aggiungere 200 microlitri di cloroformio. Vortice la soluzione per 30 secondi e incubarla per tre minuti. Dopo una microcentrifugazione di cinque minuti a 13.000 volte g e quattro gradi Celsius, trasferire 550 microlitri della fase acquosa superiore in un tubo fresco.
Aggiungere due volumi di alcol isopropile freddo e invertire il tubo da quattro a sei volte. Incubare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi centrifugarlo per 10 minuti a 13.000 volte g e quattro gradi Celsius.
Scartare il supernatante lasciando il pellet di RNA. Lavare l'RNA aggiungendo un millilitro di 75%etanolo al tubo inverterlo una volta e centrifugarlo per cinque minuti a 7, 500 volte g e quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso con cura l'etanolo, lasciare asciugare l'RNA per cinque o 10 minuti.
Quindi sciogliere il pellet in 15 microlitri di acqua priva di nucleasi. Aggiungere due microlitri di tampone di carico del DNA 6X a 10 microlitri del campione di RNA disciolto. Caricarlo su un mini gel 10%poliacrilammide prefascito.
Risolvere gli RNA per elettroforesi in tampone di corsa tris-glicina per due ore sotto una corrente costante di 16 milliampere. Una volta completata la corsa del gel, immergere il gel per cinque-10 minuti in acqua contenente un microgrammo per bromuro di etidio millilitro e rilevare i segmenti del genoma del rotavirus con un transilluminatore UV. Questo protocollo genetico inverso è stato utilizzato per generare virus SA11 ricombinanti che possono essere facilmente identificati con un saggio di placca su cellule MA104 che consente l'isolamento della placca.
I genomi dsRNA dei virus selvatici rSA11 purificati a placche e sa11-UnaG sono stati estratti con una soluzione contenente fenolo e tiocianato di guanidinio, risolti per elettroforesi su un gel di poliacrilammide al 10% e rilevati mediante colorazione con bromuro di etidio. Come previsto, il segmento sette o DSRNA NSP3 di rSA11-UnaG migrato molto più lentamente di quello del tipo selvaggio rSA11 a causa della presenza di sequenze 2A-3xFLUnaG. Per verificare l'espressione della proteina fluorescente UnaG, le cellule MA104 sono state infettate da tipo selvatico e virus ricombinante ed esaminate con un imager a cellule vive.
L'analisi ha mostrato che rSA11-UnaG produceva fluorescenza verde mentre non è stata rilevata fluorescenza nelle cellule infettate da tipo selvatico rSA11. L'analisi immunoblot è stata eseguita per indagare se l'elemento 2A di rSA11-NSP3-2A-xflUnaG promuoveva l'espressione di due proteine separate. L'analisi ha mostrato che NSP3-2A e 3xFL-UnaG erano effettivamente espressi come proteine separate che indicavano un elemento funzionale 2A.
Per un recupero riuscito del rotavirus ricombinante, è fondamentale utilizzare cellule BHKT7 di qualità e ben tenute per la trasfezione e cellule MA104 per la semina superiore e quantità accurate di plasmidi altamente puri. Sebbene questo protocollo spieghi come utilizzare il sistema genetico inverso per modificare il gene rotavirus NSP3, lo stesso approccio può essere usato per modificare altri geni come SP1.
