Le cellule staminali neurali e progenitrici possono autore rinnovarsi e differenziarsi in diversi tipi di cellule neurali, supportando lo sviluppo del sistema nervoso e offrendo una risorsa per la medicina rigenerativa. Queste cellule sono eterogenee, e dobbiamo conoscere i loro specifici marcatori di superficie cellulare per ottenere una popolazione cellulare purificata e comprenderne le funzioni. Il nostro protocollo fornisce una tecnica semplice, sensibile ed efficiente per analizzare le proteine di membrana delle cellule staminali neurali primarie e progenitrici, aiutando a identificare nuovi marcatori superficiali per queste cellule.
Il principale vantaggio del nostro protocollo è la sua capacità di analizzare direttamente il proteoma superficiale delle cellule staminali neurali primarie e progenitrici con la migliore sensibilità e specificità. Ciò si ottiene espandendoli attraverso la co-coltura all'interno delle cellule endoteliali in vitro e la via MAPK-ERK a cellule intrinseche ad alto tratto per etichettare i pori superficiali. Con le pro-modifiche dei pori sull'espansione delle cellule staminali in vitro, il nostro protocollo può essere facilmente applicato per identificare marcatori superficiali di altri tipi di cellule staminali.
Per preparare le cellule endoteliali, sospendere di nuovo un pellet di cellule BEN3 da una piastra di Petri di 10 centimetri al 90% di confluenza con nove millilitri di mezzo cellulare BEN3. Aggiungere un millilitro della sospensione cellulare in un unico inserto di supporto permeabile. Aggiungere altri due millilitri di mezzo BEN3 per pozzo nella camera inferiore della matrice.
Continuare a coltura delle cellule per un giorno a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Un giorno dopo aver placcato le celle negli inserti, aspirare delicatamente il mezzo, prima dalla camera inferiore e poi dagli inserti. Lavare la faccia degli inserti tre volte con DMEM preri warmed.
Lavare la superficie esterna degli inserti risciacquando con DMEM preri warmed. Quindi, aggiungere un millilitro di AM preri riscaldato in un unico inserto. Trasferire gli inserti nei pozzi con celle corticali primarie.
Incubare la co-coltura a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 12 ore. Sciogliere Ac4ManAz in DMSO per ottenere una concentrazione di scorte di 200 millimolare. Recuperare la piastra di co-coltura neurale-endoteliale dall'incubatore.
Aggiungere un microlitro del materiale Ac4ManAz a ogni camera inferiore e 0,5 microlitri per inserto nella co-coltura. Coltura delle cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per cinque giorni. Mentre le cellule sono coltivate aggiungere 100 microlitri di RM per inserto e 200 microlitri di RM per camera inferiore per rializzare le cellule endoteliali e neurali a giorni dall'altro.
Per prima cosa rimuovere gli inserti dalle piastre di co-coltura e aspirare il mezzo di coltura dal fondo dei pozzi. Quindi lavare le cellule neurali una volta con PBS pre-riscaldato. Aspirare il PBS dai pozzetti e aggiungere un millilitro di una paraformaldeide pre-refrigerata al 4% in PBS a ciascun pozzo.
Fissare le celle a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi lavare le cellule tre volte con PBS pre-refrigerato. Aspirare il PBS e aggiungere un millilitro di biotina appena preparata tampone coniugato 1 in ogni pozzo.
Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Successivamente, aspirare il tampone di reazione dai pozzi e lavare le cellule tre volte con PBS. Aggiungere un millilitro di tampone di colorazione ad ogni pozzo di cellule e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
Quindi, aspirare il tampone di colorazione dai pozzi e lavare le cellule tre volte con PBS pre-refrigerato. Aggiungere un millilitro di tampone di blocco a ogni pozzo di cellule e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Rimuovere il tampone di blocco dai pozzi e aggiungere un millilitro di soluzione anticorpale primaria ad ogni pozzo.
Incubare le cellule durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno dopo, rimuovere la soluzione anticorpale primaria dai pozzi. Lavare le cellule tre volte con PBS pre-refrigerato.
Aspirare il PBS dai pozzi e aggiungere un millilitro di anticorpo secondario ad ogni pozzo. Incubare le cellule a temperatura ambiente per due ore. Successivamente, aspirare la soluzione dai pozzi e lavare le cellule tre volte con PBS pre-refrigerato.
In primo luogo, preparare BTTAA cupric solfato complesso 2, buffer di sospensione completa delle proteine, tampone di lavaggio proteico 1, tampone di lavaggio proteico 2 e tampone di lavaggio proteico 3 come delineato nel protocollo di testo. Quindi, rimuovere gli inserti dalle piastre di co-coltura. Aspirare il mezzo di coltura dai pozzi inferiori e lavare le cellule neurali una volta con PBS pre-refrigerato.
Aspirare il PBS e aggiungere 200 microlitri di tampone RIPA pre-refrigerato ad ogni pozzo. Incubare le piastre sul ghiaccio per cinque minuti, quindi raccogliere la lisi proteica in tubi da 1,5 millilitri. Centrifuga a 12000 volte G e a quattro gradi Celsius per 10 minuti per pellettare i detriti cellulari.
Trasferire il supernatante in nuovi tubi da 1,5 millilitri e determinare la concentrazione proteica con un kit BCA secondo le istruzioni dei produttori. Quindi, regolare la concentrazione proteica a un milligrammo per millilitro. Aggiungere 100 biotina alchidica micromolare, ascorbato di sodio millimolare da 2,5 millimolare e complesso di solfati cuprici 1XBTTAA da 2 a un millilitro dilisi proteica.
Mescolare bene la soluzione e incubarla a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, trasferire la soluzione di reazione in 20 millilitri di metanolo pre-refrigerato in un tubo conico da 50 millilitri. Mescolare bene e incubare durante la notte a meno 30 gradi Celsius per far precipitare le proteine.
Centrifuga a 4500 volte G e a quattro gradi Celsius per 15 minuti per pellettare la proteina precipita. Lavare il pellet due volte utilizzando 20 millilitri di metanolo pre-refrigerato per lavaggio. Successivamente, aspirare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet proteico in quattro millilitri di tampone di sospensione.
Trasferire la nuova sospensione proteica in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Lavare 50 microlitri di perline di streptavidina tre volte con PBS. Aggiungere le perline lavate alla riaspensione proteica e incubare la soluzione a quattro gradi Celsius per tre ore su un rotatore verticale a una velocità di rotazione di 20 giri/min.
Dopo questo, lavare le perline in sequenza con ogni tampone di lavaggio mostrato qui. Sospendere di nuovo le perline lavate con 20 microlitri di PBS e trasferirle in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere 20 microlitri di tampone di carico proteico 2X e trattare a 95 gradi Celsius per 10 minuti.
Quindi elaborare i campioni proteici con SDS-PAGE e macchiarli con Coomassie Brilliant Blue come delineato nel protocollo di testo. In questo studio gli NSPC embrionali primari vengono espansi e metabolicamente etichettati in vitro. La co-coltura endoteliale di successo porta gli NSPC a formare cloni di grandi dimensioni simili a fogli.
L'immunostaining con gli anticorpi rivela che nel clone, la maggior parte delle cellule sono NSPC positivi alla Nestina, mentre pochissimi sono cellule neuronali positive beta tubulina 3. Al contrario, la percentuale di cellule positive di Nestin e beta tubulina 3 cellule neuronali positive nei cloni formati in un sistema non co-coltura sono quasi le stesse. Il reporter chimico Ac4ManAz è un analogo metabolico e può essere incorporato nella via di sialilazione intrinseca delle proteine.
Viene utilizzata una concentrazione di etichettatura ottimizzata di 100 micromolari per NSPC primari e la valutazione combinatoria della morte cellulare indicata dalla morfologia cellulare e dei nuclei suggerisce che questa concentrazione di etichettatura non causa evidenti effetti citotossici ed è in grado di etichettare in modo efficiente gli NSPC. La morfologia clonale, il potenziale di autori rinnovamento e differenziazione degli NSPC sia nella cocoltura endoteliale che nel sistema non co-coltura non sono influenzati. Campioni proteici preparati dalla coltura etichettata Ac4ManAz per coniugazione biotina e purificazione delle perline di streptavidina mostrano un forte segnale di colorazione Coomassie Brilliant Blue nei gel SDS-PAGE.
Nel frattempo c'erano solo segnali di riferimento di colorazione e non specifici nelle corsie cariche di campioni proteici del gruppo di controllo DMSO. Ciò indica anche l'etichettatura efficiente degli NSPC da parte di Ac4ManAz. Quando si tenta questo protocollo, tutte le soluzioni necessarie per la reazione biocellulare dovrebbero essere preparate al momento e il tempo di reazione dovrebbe essere controllato rigorosamente per evitare che la reazione non sia sufficiente.
Seguendo il nostro protocollo è possibile analizzare la struttura del glico superficiale arricchito con cellule staminali neuro. Il nostro protocollo di proteine superficiali arricchite di staminali neurali e cellule progenitrici non solo aumenta i marcatori, ma svolge anche importanti funzioni sulla strategia di purificazione del modello rialzato e sull'illustrazione dei circuiti del segnale rigiditorio per questa popolazione cellulare.
