Studiare il microambiente tumorale è difficile a causa della sua complessità. Abbiamo sviluppato microarray di microambiente costituiti da semplici microambientati combinatori che consentono l'identificazione dei principali driver dei fenotipi delle cellule tumorali. Il principale vantaggio della piattaforma MEMA è che, poiché le condizioni del microambiente sono tutte definite, è semplice identificare i fattori microambientali che guidano fenotipi di interesse.
La piattaforma MEMA è ampiamente applicabile in altri sistemi non oncologici, compresi i ceppi di cellule primarie e le cellule staminali. Ci sono una serie di trucchi e passaggi ingegneristici che abbiamo sviluppato per accelerare il lavoro sul banco bagnato e semplificare il protocollo. Per iniziare, utilizzare una stampante a spillo per stampare la miscela di stampa a matrice extracellulare in punti fiduciari in lastre a otto potte.
Utilizzare perni di diametro di 350 micrometri disposti in una configurazione della testina di stampa quattro volte e sette per stampare la matrice extracellulare per i microarray di microambiente. Il blocco di collagene viene stampato su MEMA come griglia. I pozzi riempiti di PBS forniscono ulteriore umidità per evitare l'essiccazione dalla piastra di alimentazione della miscela di stampa a matrice extracellulare.
Stampare gli array nelle lastre da otto pozzi come 20 colonne per 35 righe, per un totale di 700 punti. Dopo la stampa, conservare le lastre in un essiccatore per un minimo di tre giorni prima dell'uso. In primo luogo, progettare un layout a piastre a 96 po 'con spaziatura che consenta l'uso di una pipetta multicanale con quattro punte distanziate, in modo che il trattamento di molte piastre MEMA possa essere fatto contemporaneamente.
Quindi recuperare i ligandi dal congelatore e scongelare nel ghiaccio in una cappa di flusso laminare. Scorrere brevemente e girare giù per ogni tubo. Utilizzare il tampone consigliato dal produttore per diluire i ligandi in uno stock di lavoro 200 volte superiore.
Pipetta 10 microlitri di ogni calcio di ligando 200 volte nel pozzo corrispondente all'interno della piastra da 96 pozzi. Utilizzare la pellicola di tenuta per sigillare le piastre e conservarle a meno 20 gradi Celsius. Creare piastre di trattamento del ligando in lotti e acquisire tutti i metadati per l'analisi a valle.
Prima di coltivare le cellule, bloccare i MEMA con due millilitri per pozzo di buffer di blocco non fogliante per 20 minuti. Utilizzare uno splitter Y con due pipette Pasteur per aspirare il buffer di blocco in più pozzi contemporaneamente, quindi lavare triplicare i pozzi con PBS. Per evitare l'essiccazione, lasciare il volume finale di PBS nei pozzi fino a quando non è pronto per la placcatura cellulare.
Prima di un esperimento MEMA completo, ottimizzare la concentrazione di semina cellulare MCF7 eseguendo un esperimento di titolazione cellulare. Un punto ideale, come mostrato qui, ha numeri di cella sufficienti per estrarre i dati, ma non così tanti che il punto è esente da confluenti. Nel MEMA, aspirare le restanti cellule PBS e MCF7 di semi a 30.000-35.000 cellule per pozzo in due millilitri di mezzo di semina.
Posizionare il MEMA in un incubatore a 37 gradi Celsius. Dopo l'adesione durante la notte nell'incubatore, aspirare il mezzo e sostituire con due millilitri di mezzo di crescita ridotto per isolare l'impatto stimolante di ligandi specifici. Quindi scongelare una piastra di trattamento del ligando precedentemente congelata sul ghiaccio.
Piastra scongelata centrifuga a 200 volte g per un minuto. Trasferire 200 microlitri di mezzo da ogni pozzo nella piastra di coltura MEMA al pozzo appropriato nella piastra di trattamento del ligando. Pipettare su e giù per mescolare il ligando con il mezzo e trasferire questa miscela al pozzo appropriato nella piastra di coltura MEMA.
Dondola leggermente a mano e restituisci le piastre MEMA all'incubatore per coltura della combinazione ligando-ECM a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo 71 ore, aggiungere 100 volte EdU ai pozzi MEMA per una concentrazione finale di 10 micromolari. Incubarlo per un'altra ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Dopo l'incubazione finale, aspirare i pozzi. Fissare i MEMA in due millilitri per pozzo del 2%PFA per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi aspirare la PFA dai pozzi.
Permeabilize con due millilitri per pozzo dello 0,1% di tensioattivi non ionici per 15 minuti. Aspirare il tensioattivo, quindi lavare i pozzi con due millilitri di PBS e PBS-T, in sequenza. Successivamente, aggiungere 1,5 millilitri di reagenti di reazione di rilevamento EdU a ciascun pozzo.
Incubare per un'ora a temperatura ambiente, dondolando e protetto dalla luce. Quindi spegnere la reazione con tampone di tempra commerciale da 1,5 millilitri per pozzo. Aspirare di nuovo e lavare con PBS-T prima di incubare con concentrazioni ottimizzate di macchie o anticorpi.
Incubare i pozzi MEMA con anticorpi primari nel tampone di colorazione, dondolando a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione di anticorpi primari, lavare i pozzi con PBS seguito da PBS-T. Aggiungere anticorpi secondari in 0,5 microgrammi per millilitro DAPI, diluiti nel tampone di colorazione.
Incubare, dondolando per un'ora a temperatura ambiente al buio. Lavare i pozzi due volte con due millilitri per pozzo di PBS e lasciarli negli ultimi due millilitri di PBS. Per l'immagine macchiata di MEMA, posizionarla sul palco del microscopio di un sistema di imaging automatizzato con adeguati canali di rilevamento fluorescenti.
Output dei dati dell'immagine risultanti in un sistema di gestione delle immagini. Segmentare le celle e calcolare i livelli di intensità utilizzando CellProfiler. In questo protocollo, i profili del ciclo cellulare dei valori di intensità DAPI binned rispetto al conteggio delle celle da una piastra a otto pozzi indicano le celle nella fase del ciclo cellulare G1 rispetto a G2.
Ciò corrisponde a due contenuti di nDNA nelle cellule nella fase iniziale di crescita e a quattro contenuti di nDNA nelle cellule che sta per subire la mitosi. Viene mostrato l'impatto del microambiente dei ligandi e dell'ECM sia sul numero di cella che sull'incorporazione dell'EdU. Il rosso indica un numero di cella più alto e il blu è un numero di cella inferiore.
Molti degli effetti sono guidati dal ligando, poiché la condizione ECM non ha avuto un forte impatto sul numero di cellulare o sulla positività dell'EdU. Natagen 1 è una chiara eccezione, poiché la presenza di questa molecola ECM inibisce il legame cellulare e la crescita di MCF7. Ligandi come FGF6 e neuregulin-1 alfa migliorano il numero di cellule e hanno alti tassi di incorporazione di EdU, mentre ligandi come anfiregulina e neuregulina-1 SMDF inibiscono il legame cellulare e la crescita delle cellule.
Un esempio di cellule MCF7 che crescono su un punto MEMA trattato con neuregulin-1 alpha mostra alti tassi di incorporazione di EdU, indicati dai nuclei rosa. In questa immagine, la macchia verde è maschera di cella e il blu è DAPI. Poiché un esperimento MEMA completo è costoso, è molto importante eseguire passaggi di ottimizzazione, come titolazioni cellulari e siere, prima di eseguire l'esperimento completo.
Una volta identificate le condizioni microambientali di interesse utilizzando la piattaforma MEMA, i ligandi specifici e le proteine della matrice extracellulare possono essere studiati in modo più approfondito utilizzando i tradizionali sistemi di coltura cellulare 2D e 3D.
