Questo è un metodo per applicare la stimolazione elettromeccanica sulle cellule. Ha molteplici applicazioni per studiare i suoi effetti su una popolazione cellulare, pre-allenamento per la consegna in vivo e maturazione cellulare. Il vantaggio è che gli stimoli elettrici e meccanici possono essere applicati con lo stesso dispositivo singolarmente o simultaneamente mantenendo intatto il virale sterile.
Questa tecnica è un approccio indiretto alla nostra terapia. La terapia cellulare è considerata cellule stimolate elettromeccanicamente può essere un'interessante popolazione cellulare per trattare l'intro-miocardio. Questo metodo appartiene generalmente al campo cardiovascolare, ma potrebbe anche essere applicato al sistema nervoso.
Questa è una tecnica facile che richiede pazienza. La parte più difficile sarà lavorare con i piccoli pezzi e mantenere la sterilità per tutto il tempo. Ci sono pochi dettagli di manipolazione che sono difficili da spiegare, quindi la dimostrazione visiva è davvero utile.
Inizia trasferendo 12 costrutti PDMS puliti su piastre sterili da 10 centimetri. Per assicurare la completa sterilizzazione, esporre le piastre alla luce UV per cinque minuti. Quindi trasferire ogni costrutto su una piastra di coltura cellulare separata di 35 millimetri o piastre a 6 po 'per la semina immediata delle cellule.
Per iniziare la semina cellulare, lavare prima un pallone T75 confluente di ATDPC cardiaci con cinque millilitri di 1x PBS. Per scollegare le celle, aggiungere un millilitro dello 0,05% di tripside-EDTA. E incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Quindi, aggiungere cinque millilitri di mezzo completo per inattivare la tripina-EDTA. Raccogliere tutte le celle staccate in un tubo da 15 millilitri. Lavare il vetro cellulare due volte con cinque millilitri di PBS per raccogliere eventuali celle rimanenti e aggiungerle al tubo da 15 millilitri.
Centrifuga a 230 g per cinque minuti a 22 gradi Celsius. Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in due millilitri di mezzo completo e contarle con l'emocitometro. Seme 200 microlitri di ATDPC cardiaci in ogni piastra con i costrutti PDMS per ottenere circa l'80% della superficie di semina coperta da cellule il giorno seguente.
Incubare a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Aggiungere delicatamente 2 millilitri di mezzo completo preri riscaldato per piastra. Incubare le cellule con i costrutti a 37 gradi Celsius e 5%CO2 durante la notte.
Prima di iniziare questa procedura, assegnare sei costrutti su 12 per la stimolazione elettromeccanica e conservarne sei per i controlli non stimolati. Utilizzare il 70% di etanolo per pulire l'unità di stimolazione. Posizionare l'unità di stimolazione, gli elettrodi sterili e le pinzette all'interno dell'armadio di flusso.
Per manipolare facilmente gli elettrodi e i costrutti, rimuovere il 90% del mezzo da ogni piastra di coltura cellulare. Posizionare i costrutti PDMS nella posizione giusta verso il magnete per assicurare l'attrazione magnetica tra magneti fissi e mobili. Questi due passaggi precedenti in cui manipoli i costrutti PDMS seminati della cellula e gli elettrodi mantenendo la sterilità durante tutto il processo sono i più critici.
Quindi, collegare il filo di platino ai connettori dell'elettrodo. Orientate la parte PTFE degli elettrodi nei loro spazi designati nei costrutti PDMS. Aggiungere 2,5 millilitri di mezzo completo fresco preri warmed per ogni costrutto.
Una volta posizionati e collegati elettricamente alla piattaforma tutti i costrutti PDMS, riposizionare la piattaforma nell'incubatore di 37 gradi Celsius e 5%CO2. Quindi collegare la sorgente elettrica e meccanica. Per configurare il programma di stimolazione, specificare i regimi di stimolazione elettrica e meccanica attraverso le interfacce utente dello stimolatore elettrico e l'applicazione, che controlla la stimolazione meccanica.
Per impostare il sincronismo, accendere lo stimolatore elettrico e attendere che il menu principale venga visualizzato sul display. Quindi selezionare l'opzione due, modificare la sequenza e quindi INVIO. Per modificare il menu di sequenza, utilizzare la scheda modalità per selezionare corrente"facendo clic su più" e premendo INVIO"Per il periodo, selezionare 1000"con più/meno e premere INVIO"E per la scheda modalità trigger, selezionare esterno per software e premere INVIO"Per la scheda ampiezza, selezionare 1"con più/meno e premere INVIO"Quindi, di nuovo nel menu principale, selezionare l'opzione 4, quindi generare sequenza, quindi premere INVIO"Nella sezione di stimolazione meccanica del pannello applicazione di controllo, prima scrivere 1000" nel controllo del testo del periodo più.
Quindi scrivi 500" nel controllo del testo on time, per impostare la durata meccanica dell'impulso. Infine, scrivi 2000" nel controllo del testo dell'escursione per fornire un allungamento del 10% del costrutto. Cambiare il supporto cellulare due volte a settimana, rimuovendo prima i vecchi supporti e quindi aggiungendo supporti caldi e freschi sui lati del supporto PDMS.
Il settimo giorno, alla fine dell'esperimento, raccogliere i campioni come descritto nel manoscritto. Gli ATDPC cardiaci stimolati elettromeccanicamente hanno migliorato il loro potenziale cardiomiogenico. Questo è stato indicato dalla PCR in tempo reale che mostra una maggiore espressione dei geni cardiaci precoci e tardivi in particolare il fattore di trascrizione cardiaca GATA-4, la catena pesante della beta-miosina del marcatore strutturale e il gene correlato al calcio Connexin43.
La colorazione della phalloidina contro le fibre di actina ha mostrato che la maggior parte delle cellule allineate secondo il modello verticale. La distribuzione di Connexin43 era principalmente nel citoplasma e nella membrana plasmatica, contribuendo alla comunicazione intracellulare attraverso le giunzioni gap. I fattori di trascrizione MEF2 e GATA-4 sono stati localizzati nei nuclei negli ATDPC cardiaci.
Ma GATA-4 non è stato rilevato negli ATDPC sottocutanei. I marcatori citoplasmatici SERCA2, e l'alfa-actina sarcomerica, non mostravano un'organizzazione sarcomerica matura tipica dei cardiomiociti. E il pestaggio non è stato osservato nel controllo e ha stimolato le popolazioni cellulari.
Un monostrato cellulare sano all'inizio di questo protocollo e mantenere la sterilità durante tutta la procedura sono cruciali. Dopo la raccolta del campione, è possibile eseguire le tecniche standard di espressione delle proteine del genoma. Questa tecnica aiuta a comprendere meglio l'effetto degli stimoli elettrici e/o meccanici cellulari.
Fino a poco tempo fa, era impossibile utilizzare lo stesso dispositivo per entrambe le stimolazioni, il che rendeva i risultati più difficili da confrontare.
