Il nostro protocollo aiuta gli investigatori a implementare pipeline sperimentali standardizzate per eseguire la caratterizzazione fenotipico di popolazioni simili mediante colorazione immunofluorescente. Con questa tecnica, i ricercatori possono analizzare rigorosamente la composizione simile di tessuti di malattie complesse ed eseguire analisi qualitative e quantitative dei fenotipi dei tipi cellulari di interesse. A dimostrare la procedura sarà Sidney Mahan, un tecnico del mio laboratorio.
Per preparare l'animale al raccolto di arteria brachiocefalica, tagliare il peritoneo fino allo sterno, facendo attenzione a non danneggiare i tessuti addominali. E fare due tagli alla linea medio-ascellare attraverso il torace, facendo attenzione a non danneggiare il cuore e i polmoni. Quindi, tagliare il diaframma per esporre parzialmente il cuore.
Per profusare il topo, installare un sistema di profusione gravitazionale in modo tale che la pressione del fluido di profusione sia equivalente alla pressione sanguigna murina media per consentire una profusione costante e il mantenimento della morfologia del vaso. Quindi, profuse l'animale con cinque millilitri di PBS a temperatura ambiente, 10 millilitri di paraformaldeide a temperatura ambiente al 4% e cinque millilitri aggiuntivi di PBS a temperatura ambiente. Collegare un ago a farfalla calibro 23 o 25 al sistema di profusione gravitazionale ed eseguire PBS attraverso l'ago per espellere l'aria dai tubi prima di inserire l'ago nel ventricolo sinistro.
Dopo aver assicurato l'ago in posizione, utilizzare le forbici dell'iride per fare un'incisione di meno di due centimetri nell'atrio destro. Raccogliere i tessuti di interesse in paraformaldeide fresca al 4%. Per esporre l'arteria brachiocefalica, utilizzare le forbici per fare un'incisione lungo la linea mediana dello sterno attraverso il manubrio e utilizzare le forcette per tirare entrambi i lati della gabbia toracica per aprire completamente la cavità toracica.
Successivamente, posizionare l'animale al microscopio sezionato per visualizzare parzialmente le carotidi e utilizzare pinzette fini per tirare i muscoli, il tessuto connettivo e il grasso fino a quando la carotide destra, l'arteria brachiocefalica, la biforcazione succlavia e l'arco aortico vengono puliti e isolati dal tessuto connettivo e dal grasso circostanti. Quindi, usa le flessce per afferrare la carotide destra sotto la sua biforcazione e fare un taglio iniziale sopra le forcep. Tuttavia, tenendo la carotide, fai un secondo taglio attraverso l'arteria succlavia e fai gli ultimi due tagli attraverso l'arco aortico su entrambi i lati dell'arteria brachiocefalica.
Quindi, raccogliere tutti gli altri tessuti vascolari di interesse e posizionare l'arteria brachiocefalica e gli altri tessuti in una soluzione di paraformaldeide al 4% durante la notte a temperatura ambiente. Per la colorazione immunofluorescente dell'arteria brachiocefalica, utilizzare un microtomo per ottenere sezioni di 10 micrometri attraverso il campione di tessuto incorporato nella paraffina fino a quando la microscopia luminosa non può confermare che l'arco aortico è stato sescato e l'arteria brachiocefalica è visibile. Regolare l'orientamento del blocco fino a quando il tessuto non è completamente perpendicolare alla lama del microtomo e ottenere tre sezioni seriali spesse 10 micrometri dell'arteria brachiocefalica per scivolo di vetro, fino a raggiungere la biforcazione succlavia.
Una volta raccolte tutte le sezioni, idratare i campioni di tessuto sotto una cappa chimica con due immersioni in xilene di cinque minuti, seguite da una serie di etanolo ad immersione di cinque minuti come indicato e due immersioni in acqua deionizzata di cinque minuti. Successivamente, incubare le diapositive in soluzione di recupero dell'antigene, secondo protocolli standard, seguita dal riscaldamento in un forno a microonde per 20 minuti. Dopo un'ora di raffreddamento a temperatura ambiente, utilizzare una penna idrofobica per circondare ogni sezione tissutale.
E blocca qualsiasi legame non specifico con buffer di blocco per un'ora a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, etichettare i campioni di tessuto durante la notte a quattro gradi Celsius con il cocktail di anticorpi primari di interesse, o anticorpi di controllo IgG abbinati all'isotipo. La mattina seguente, lavare gli scivoli tre volte in PBS per cinque minuti per lavaggio, seguito da un'incubazione di un'ora nell'appropriato cocktail di anticorpi secondari coniugati a fluorescenza e DAPI per la visualizzazione del nucleo.
Quindi, utilizzare un supporto di montaggio adatto per la microscopia a fluorescenza per montare le coverlips sulle diapositive. Per l'imaging in microscopia confocale delle sezioni di tessuto etichettate, utilizzare sezioni macchiate con il controllo IgG e gli anticorpi primari per impostare la sensibilità, la potenza laser e l'offset del rivelatore per ogni singolo canale. Quindi, impostare le posizioni superiore e inferiore per l'acquisizione dello stack Z e determinare lo spessore e il numero di pile da imaged.
Una volta acquisite tutte le immagini, apri le immagini in ImageJ e apri il pannello degli strumenti del canale e pseudocolora i diversi canali di colorazione. Unire i canali di colore. Tutti i canali dovrebbero diventare visibili sulla stessa immagine.
Attivare e disattivare i singoli canali di colore all'interno del pannello strumenti canale e fare clic con il pulsante destro del mouse sull'icona di conteggio per selezionare lo strumento multi-punto. Fare doppio clic sull'icona di conteggio per aprire il pannello degli strumenti punto e selezionare il tipo e le dimensioni degli elementi utilizzati per contare le celle. Controlla mostra tutto e attiva il canale DAPI solo nel pannello strumenti del canale.
Quindi, selezionare il canale del contatore zero e fare clic sui singoli nuclei da taggare, scorrendo le z-stack per contare tutti i nuclei macchiati all'interno della regione di interesse. Il numero di eventi quantificati a cella singola sarà indicato di seguito nel pannello strumenti a punti. Quando tutti i nuclei sono stati taggati, accendere un altro canale di colorazione e selezionare il canale di contatore uno per etichettare le cellule in cui c'è una colocalizzazione tra DAPI e la colorazione degli anticorpi.
Per la colorazione citoplasmatica, selezionare le cellule con colorazione che circondano il nucleo per tutta la profondità del nucleo, controllando più z-stack se necessario. I risultati possono quindi essere espressi come il numero di celle al numero totale di cellule positive DAPI o il numero di celle per area all'interno dell'area di interesse. La colorazione immunofluorescente con anticorpi mirati marcatori fenotipico, come dimostrato, consente di acquisire immagini di ogni singola colorazione marcatore e contrasto di interferenza differenziale per la delimitazione delle regioni di interesse per il conteggio a singola cellula.
Il conteggio delle singole cellule per determinare l'abbondanza di diverse popolazioni leali derivate dalle cellule muscolari può quindi essere eseguito utilizzando ImageJ. Ad esempio, l'analisi del conteggio a singola cellula nella regione del tappo fibroso di queste sezioni trasversali rappresentative ha rivelato notevoli differenze nella composizione cellulare dell'area del cappuccio fibroso tra topi trattati con anticorpi beta anti IL-1 e topi trattati con un controllo IgG abbinato all'isotipo. In effetti, l'inibizione di IL-1 beta è stata associata a una diminuzione delle cellule muscolari lisce positive all'YFP e ad un aumento delle cellule galectin-3-positive.
Inoltre, è stata osservata una diminuzione del numero di cellule muscolari lisce aortiche alfa actina positiva all'YFP. Mentre il numero relativo di macrofagi YFP-positivi alla galectina-3-positivi derivati dalle cellule muscolari lisce è stato significativamente aumentato in entrambe le posizioni dell'arteria brachiocefalica. In particolare, l'inibizione di IL-1 beta non ha influenzato il numero complessivo di cellule osteocondrogeniche all'interno della lesione, o la proporzione di cellule condrogeniche derivate da cellule muscolari lisce o derivate da macrofagi.
Questo protocollo è stato progettato per migliorare il rigore e la riproducibilità nell'analisi della lesione aterosclerotica standardizzando passaggi chiave come la raccolta, l'elaborazione e il sezionamento dei tessuti, nonché il conteggio a singola cellula. Questo protocollo può essere utilizzato per analizzare letti vascolari aggiuntivi inclini a presentare lesioni aterosclerotiche tra cui l'aorta e la radice aortica.
