La preparazione di campioni compatibili con la spettrometria di massa di alta qualità per un'analisi completa del proteoma di campioni oculari è fondamentale per chiarire i meccanismi molecolari e le vie di segnalazione implicate nella salute e nelle malattie. Il flusso di lavoro descritto rappresenta un approccio semplice ma robusto a rigorose fasi di preparazione dei campioni destinate specificamente all'analisi di campioni limitati alla massa come i micro vasi sanguigni oculari. Sebbene l'obiettivo principale dello studio sia quello di stabilire una metodologia compatibile con la SM per i vasi sanguigni oculari, il flusso di lavoro descritto può essere ampiamente applicato a vari campioni cellulari e tissutali.
Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo possono lottare perché l'identificazione e l'isolamento dell'arteria ciliaria posteriore corta scelta, o rami SPCA, può essere impegnativo. Gli occhi suini freschi, insieme al nervo ottico e ai tessuti extraoculari, sono stati ottenuti dal mattatoio locale immediatamente dopo la mortem. Posizionare il globo oculare in una camera di dissezione contenente tampone Krebs-Henseleit ghiacciato.
Tagliare con cura i muscoli e i tessuti circostanti con un paio di forbici Mayo affilate. Fai un'incisione con un bisturi e taglia il globo lungo il piano equatoriale con un paio di forbici Mayo affilate fino a quando l'occhio non viene separato nelle metà anteriore e posteriore. Rimuovere il maggior numero possibile di corpo vitreo dalla metà posteriore dell'occhio utilizzando un paio di forcep standard.
Dopo aver usato perni di dissezione per fissare con cura la metà posteriore dell'occhio, tagliare delicatamente i tessuti connettivi che circondano il nervo ottico, per esporre la vascuola retrobulare sottostante con un paio di forbici a molla Vannas studentesse. Isolare l'arteria ciliaria posteriore corta paraottica e distale insieme ai tessuti connettivi circostanti con un paio di pinzette di precisione di tipo cinque e forbici per capsulotomia Vannas. Rimuovere delicatamente i tessuti connettivi dai segmenti arteriosi utilizzando pinzette e forbici con punta extra fine prima di risciacquare le arterie isolate nel PBS ghiacciato per rimuovere contaminanti e residui di sangue.
Mettere in comune le arterie da due occhi per ottenere una replica biologica, quindi pesare i campioni utilizzando un equilibrio analitico. Ad ogni tubo aggiungere una miscela di perline di ossido di zirconio da 0,5 e un millimetro seguita da reagente di estrazione delle proteine tissutali. Ora, caricare i tubi campione in un omogeneizzatore di frullatore.
Impostare il timer su due minuti, impostare il livello di velocità su sei e avviare l'omogeneizzazione. Dopo l'esecuzione, controllare i campioni per l'omogeneizzazione completa e tenere i campioni sul ghiaccio tra una corsa e l'altro. Ripetere il ciclo fino a quando i campioni non sono completamente omogeneizzati.
Pipettare con cura omogeneizzare in tubi di microcentrifugo fresco. Centrifugare i campioni a 10.000 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius per pellet proteine insolubili. Pipettare con cura il supernatante contenente le proteine solubili senza toccare lo strato di pellet e trasferirlo in tubi di microcentrifugo fresco.
Aggiungere 200 microlitri di Extraction Buffer 2A e cinque microlitri di cocktail inibitore della proteasi a ciascun campione di pellet. Quindi, sospendere il pellet più volte con una pipetta. Utilizzare un omogeneizzatore ad ultrasuoni per omogeneizzare completamente il pellet.
Impostare l'ampiezza su 60 e pedalare su uno. Utilizzare una sonda in titanio, appropriata per l'omogeneizzazione di campioni con piccoli volumi. Immergere la sonda nella miscela di pellet e tampone di estrazione sul ghiaccio e premere il pulsante di avvio.
Sonicare il campione fino a quando i grumi di pellet non sono completamente omogeneizzati, fermandosi per alcuni secondi tra ogni sonicazione. Verificare visivamente la completa omogeneizzazione. Mescolare l'omogeneizzato più volte con una pipetta per assicurarsi che non ci siano grumi.
Utilizzare dispositivi filtranti centrifuga con taglio a tre kilodalton per questa procedura. Inserire l'unità filtrante cutoff a tre kilodalton in un tubo di microcentrifugo. Pipettare 200 microlitri di omogeneizzato campione a un dispositivo filtrante e aggiungere 200 microlitri di acqua deionizzata nello stesso filtro.
Dopo averlo tappato in modo sicuro, posizionare l'unità filtrante in una centrifuga e ruotare per 14.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, separare l'unità filtrante contenente il concentrato del campione dal tubo di microcentrifugo contenente il filtrato, scartando il filtrato. Ricostituire il concentrato aggiungendo 400 microlitri di acqua deionizzata nell'unità filtrante.
Dopo aver ripetuto la filtrazione tre volte, pipettare accuratamente il concentrato del campione pulito in un microtubo pulito. Preparare i campioni per l'elettroforesi del gel unidimensionale come elencato nel protocollo di testo e mescolare bene con una pipetta. Riscaldare i campioni a 70 gradi Celsius in un riscaldatore a blocchi asciutti per 15 minuti e raffreddare a temperatura ambiente.
Caricare con cura 50 microgrammi di campione per corsia utilizzando una pipetta, così come lo standard proteico prestained come marcatore di massa molecolare. Eseguire i gel per circa 60 minuti a una tensione costante di 175 volt. Alla fine della corsa, rimuovere con cura il gel dalla piastra della cassetta usando un coltello in gel e trasferire il gel in una scatola di colorazione in gel.
Eseguire il fissaggio e la colorazione del gel come descritto nel protocollo di testo. Agitare i gel nella soluzione di colorazione durante la notte per ottenere i migliori risultati complessivi. Decantare con cura la soluzione di colorazione e sostituirla con 200 millilitri di acqua deionizzata prima di scuotere i gel per almeno sette-otto ore in acqua per liberare lo sfondo.
Asporta le fasce proteiche dal gel con nuove lame di microtomo pulite. Tagliare la banda a piccoli pezzi e trasferire accuratamente i pezzi di gel in tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di destaining contenente bicarbonato di ammonio da 100 millimolare e acetonitrile.
Incubare i campioni a temperatura ambiente per 30 minuti, con occasionali scosse. Pipettare con cura la soluzione di destaining. Controllare visivamente eventuali tubi con macchia residua e ripetere questo passaggio se i pezzi di gel sono ancora macchiati di blu.
Aggiungere circa 400 microlitri di soluzione DTT preparata al momento e incubare a 56 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo aver scartato la soluzione riducente con una pipetta, aggiungere circa 400 microlitri di soluzione IAA appena preparata e incubare al buio a temperatura ambiente per 30 minuti. Rimuovere il tampone alchilante con una pipetta e scartare.
Aggiungere 500 microlitri di acetonitrile pulito a temperatura ambiente per 10-15 minuti, fino a quando i pezzi di gel si restringono e diventano opachi. Pipettare l'acetonitrile e asciugare ad aria i pezzi di gel per cinque-10 minuti sotto il cofano. Quindi, pipettare 50 microlitri di soluzione di triptina in ogni tubo per coprire completamente i pezzi di gel e incubare i tubi a quattro gradi Celsius.
Dopo 30 minuti, aggiungere un volume sufficiente di tampone di tripina per coprire completamente i pezzi di gel, se necessario. Incubare i campioni durante la notte a 37 gradi Celsius. Per eseguire l'estrazione peptidica, pipettare con cura la soluzione peptidica estratta dai tubi e trasferirli su microtubi puliti.
Asciugare il supernatante in un evaporatore a vuoto centrifugo. Aggiungere 100 microlitri di tampone di estrazione a ciascun tubo con pezzi di gel e incubare per 30 minuti con scuotimento. Pipettare il supernatante negli stessi microtubi contenenti i peptidi estratti in base alle rispettive bande e asciugare in una centrifuga sottovuoto.
Procedere alla purificazione peptidica e alle analisi MS/MS di cromatografia liquida-ionizzazione elettrospray come descritto nel protocollo di testo. La quantità totale di proteine nei campioni estratti con ogni tipo di detergente è raffigurata qui. La resa più elevata proveniva dai tessuti estratti con tampone di estrazione delle proteine tissutali, seguita da DDM, CHAPS, ASB-14 e la resa più bassa da ACN e TFA.
Costantemente, le proteine totali identificate erano anche le più alte nel tampone di estrazione delle proteine tissutali estratto campione, e seguivano la stessa tendenza della resa totale. Ecco il confronto dei profili proteici di elettroforesi in gel a una dimensione di SPCA, prima e dopo essere stati sottoposti alle fasi ottimizzate di preparazione e pulizia del campione. Nel complesso, un alto grado di sbavatura e scarsa separazione delle bande proteiche è stato osservato alla terza corsia.
Questo profilo dimostra che i campioni possono contenere reagente di estrazione e anche contaminanti come lipidi e detriti cellulari. Tuttavia, i campioni SPCA che sono stati separati in supernatante e pellet, e poi sottoposti al protocollo ottimizzato, hanno portato a profili di elettroforesi in gel unidimensionali esemplari. Il metodo ottimizzato per un'estrazione rapida, robusta ed efficiente delle proteine da microvessel oculari può anche essere prontamente applicato ad altri campioni a base tissutale.
Qui sono mostrati i profili proteici del supernatante e il pellet di campioni di cervello murino e tessuto cardiaco. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di sottoformare i campioni alla completa omogeneizzazione, di separare il supernatante dal pellet e di rimuovere i contaminanti e i reagenti di estrazione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'oftalmologia sperimentale e traslazionale per esplorare a fondo il proteoma della vascolarizzazione oscolare usando gli occhi suini come modello.
