Questo protocollo facilities la preparazione di una soluzione di lavoro di granuli per studi in vivo, nonché la preparazione di siero contenente granuli per esperimenti in vitro. Un vantaggio di questa tecnica è che il metodo può essere facilmente ripetuto a causa del basso costo dei materiali e degli animali che crei per gli esperimenti. Inizia aggiungendo otto, 16 e 24 grammi di gushukang, o GSK, granuli a singoli tubi da 50 millilitri.
Aggiungere 48 millilitri di acqua ad ogni tubo e agitare i tubi per sciogliere completamente i granuli. Quindi, posizionare 1,6 compresse di carbonato di calcio integrato con vitamina D3 in un altro tubo da 50 millilitri e sciogliere le compresse in 48 millilitri di soluzione salina con agitazione. Per la somministrazione intragastrica delle soluzioni, in primo luogo trattenere delicatamente ma saldamente manualmente un topo C57 Black 6 di un mese, femmina, per due o tre minuti.
Quando il mouse si è calmato, caricare un ago di gavage numero 12 di 40 millimetri con 0,24 millilitri di una soluzione funzionante di granuli GSK e posizionare l'ago di gavage nel mouse attraverso un lato della bocca fino a quando non si sente la resistenza dell'ago, indicando che l'ago ha raggiunto lo stomaco. Iniettare l'intero volume di soluzione di lavoro nell'animale. Quindi, ritrarre l'ago di gavage e riportare il topo nella sua gabbia mentre agli altri topi viene somministrato GSK prima di iniettare 0,24 millilitri di carbonato di calcio e soluzione di vitamina D3 in ogni topo nello stesso modo.
Per la raccolta del siero del sangue contenente GSK, dopo aver consegnato le concentrazioni appropriate di GSK a un ratto per gavage come appena dimostrato, confermare una mancanza di risposta al dito del giorno un'ora dopo l'ultima somministrazione di granuli GSK. Fai una pelle addominale e un'incisione peritoneale ed esponi l'addome al fondo del torace. Utilizzare carta velina per rimuovere il tessuto connettivo dell'aorta addominale per esporre chiaramente il vaso e utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago calibro 22 per prelevare il sangue dall'aorta.
Trasferire il sangue in un tubo sterile da 15 millilitri e posizionare il tubo in posizione verticale a temperatura ambiente per 30-60 minuti. Quando il sangue si è coagulato, centrifugare il tubo per separare il siero e trasferire tutto il siero per un massimo di sei ratti in un nuovo tubo da 50 millilitri. Agitare il tubo per mescolare i sieri prima di inattivare i componenti del siero in un bagno d'acqua Celsius di 56 gradi per 30 minuti.
Quindi, filtrare il siero attraverso un filtro a siringa polieteresolfone idrofilo di dimensioni di 0,22 micrometri per la conservazione a meno 80 gradi Celsius per un massimo di un anno. Per l'osteoclastogenesi in vitro, diluire i tre dosaggi del siero contenente GSK ad un rapporto uno-quattro con il mezzo minimo dell'Aquila integrato con L-glutammina, ribonucleosides e deossiribonucleosides. Aggiungere 200 microlitri di ogni diluizione ad ogni pozzo di una coltura di macrofagi del midollo osseo in una piastra da 96 porri.
Quindi, inizia l'ultima generazione stimolando ogni pozzo con fattore stimolante per la colonia di macrofagi e attivatore del recettore per il ligando del fattore nucleare-kappa B. Per l'osteoblastogenesi in vitro, aggiungere due millilitri di siero diluito contenente GSK ad ogni pozzo di una coltura di cellule staminali mesenchimali ossee a 24 pozzi. I risultati della scansione della tomografia micro-calcolata indicano che i topi ovariectomizzati dimostrano una significativa perdita ossea rispetto ai topi di controllo salini.
L'intervento con 90 giorni di trattamento con granulo GSK aumenta notevolmente la densità del midollo osseo, in particolare negli animali trattati con GSK a media dose. Il trattamento con granulo GSK porta anche ad un aumento del numero osseo trabecolare, del volume osseo sul volume totale e dello spessore osseo trabecolare, ma una diminuzione della separazione ossea trabecolare. La colorazione della fosfatasi acida resistente ai tartrati, o TRAP, rivela un aumento del numero di osteoclasti nei topi ovariectomizzati rispetto agli animali di controllo, mentre i trattamenti dei granuli GSK riducono la differenziazione osteoclasta positiva trap rispetto agli animali ovariectomizzati.
Il siero contenente granuli GSK riduce anche il numero di osteoclasti positivi trap rispetto al siero raccolto dagli animali di controllo. La penetrazione riuscita dell'ago nell'aorta addominale è fondamentale per garantire che un sangue abbastanza alto sia raccolto da ogni ratto. Un'esecuzione riuscita di questo metodo dovrebbe assegnare l'accumulo di 15-20 millimetri di sangue, abbastanza materiale da utilizzare per esperimenti in vitro.
