Il nostro protocollo sfrutta la somministrazione locale del neurotrasmettitore inibitorio naturale GABA utilizzando un dispositivo molto nuovo, che potrebbe proporre una nuova soluzione nel trattamento delle convulsioni epilettiche. La pompa ionica microaerofila ci permette di avere un controllo molto preciso su quando e dove consegniamo farmaci. Il parto elettroforetico filettato con precisione potrebbe essere modificato per colpire altre malattie neurologiche.
Un altro vantaggio di questa tecnica di somministrazione dei farmaci è che c'è un aumento di pressione molto trascurabile all'uscita per la somministrazione di farmaci perché non c'è fluido che viene effettivamente consegnato. Piuttosto, sono solo le molecole di farmaci stesse. Poiché la localizzazione ravvicinata delle sonde porrà il problema maggiore, è molto adivisibile testare i loro angoli di allineamento e il posizionamento con sonde fittizie nel telaio stereotassico.
Inizia fissando la testa di un mouse anestetizzato in un telaio stereotassico e usando un ago calibro 30 per iniettare un analgesico locale per via sottocutanea nel sito di incisione pianificato. Dopo cinque minuti, usa un bisturi per fare un'incisione della linea mediana nel cranio. E utilizzare forcep fini per ritrarre delicatamente la pelle.
Bloccare la pelle con morsetti di serofine bulldog. E pulire la superficie del cranio esposta della fascia. Utilizzando un trapano dentale con una punta di perforazione fine e rotonda di 0,4 millimetri, praticare un foro nel cranio sopra il cervelletto fino a quando la dura non è visibile.
Posizionare la vite di terra nel foro e utilizzare un cacciavite di precisione per ruotare la vite fino a raggiungere la parte superiore del cervelletto. Utilizzando il telaio stereotassico, misurare le coordinate stereotassiche per la regione cerebrale desiderata e utilizzare il trapano impostato a una velocità elevata per assottigliare un'area di diametro di circa uno o due millimetri del cranio, intorno alla regione bersaglio, fino a quando non rimane una membrana ossea trasparente sottile e ben lucidata. Quindi, utilizzare un ago a punta uniata su misura per rimuovere la dura e aggiungere una goccia di soluzione salina nel foro risultante.
Per l'inserimento di sonde di silicio multicanale, posizionare la sonda sul braccio stereotassico collegato a un supporto magnetico e posizionare il braccio accanto al telaio stereotassico. Impostare i bracci stereotassi in un leggero angolo anteriore-posteriore di 20 gradi per lasciare ampio spazio al posizionamento degli altri due impianti. E collegare la sonda allo stadio di testa e alla vite di terra.
Utilizzare il braccio stereotassico preciso per micron per abbassare lentamente la sonda di silicio nell'ippocampo e avviare il software di registrazione per registrare i segnali neuronali elettrici mentre si sposta la sonda di silicio multicanale dalla parte superiore della corteccia fino a raggiungere la posizione dorsoventrale mirata. Quindi, registra contemporaneamente il segnale potenziale di campo locale dagli strati della corteccia e dell'ippocampo durante la penetrazione sullo schermo del computer e usa l'attività dell'increspatura nello strato piramidale della formazione ippocampale nel potenziale di campo locale registrato come marcatore della zona bersaglio. Per il riempimento della pompa ionico microfluidico, collegare i tubi all'ingresso della pompa e riempire la sonda con soluzione GABA molare 0,05.
Rimuovere i tubi e chiudere l'ingresso con l'avvolgimento della pellicola di paraffina e assicurarsi che la pompa ionica microfluidico sia fissata saldamente al supporto. Prestare attenzione quando si monta il supporto sul braccio del micromanipolatore prima di collegare i cavi elettrici all'unità di misurazione della sorgente. Con il braccio stereotassico ad un angolo medio-laterale di 20 gradi, abbassare lentamente la pompa con movimenti assiali il più vicino possibile alla sonda senza lasciare piegare la pompa, fino a quando la pompa raggiunge la coordinata dorsoventrale negativa a 1200 micrometri dalla superficie corticale.
In preparazione per l'induzione del sequestro, rimuovere il mozzo dell'ago metallico di una siringa da 10 microliter e fissare una micropipetta borosilicata sulla punta della siringa. Posizionare il mozzo sulla punta della micropipetta e posizionare la siringa con un angolo mediale laterale di 20 gradi. Utilizzare una pompa di microiniezione automatizzata per caricare da 500 a 1000 nanolitri di aminopiridina completa da 50 millimolare nel liquido cerebrospinale artificiale nella siringa e abbassare la micropipetta di vetro nella posizione coordinata dorsoventrale.
Iniettare 250 nanolitri della soluzione nel cervello e avviare la registrazione nel software. Quindi, guarda lo schermo e attendi che venga visualizzato il primo picco interictale prima di applicare un volt tra la sorgente e il bersaglio per 100 secondi e un secondo di riposo per 30 cicli per fornire la soluzione GABA. La localizzazione precisa degli impianti aiuta a registrare i potenziali di campo locali ippocampali, inducendo le piccole convulsioni ippocampali e fornendo GABA all'inizio della crisi epilettica.
Inoltre, la localizzazione degli impianti può essere verificata dopo ogni esperimento mediante istologia post hoc. Qui, viene mostrato un esempio di quando eventi simili a crisi epilettiche potrebbero essere interrotti con la consegna di GABA dalla nuova sonda neuronale, incorporando la sonda microfluidico. Quando quattro amminopiridine sono state iniettate in un'area più ampia o sulla parte superiore della corteccia, le convulsioni epilettiche sono diventate generalizzate, quindi il GABA consegnato non è stato in grado di modificare l'estensione delle convulsioni epilettiche.
In particolare, la consegna di ioni di sodio non ha avuto un effetto significativo sull'attività indotta da aminopiridina. Quindi questo protocollo può essere utile per qualsiasi chirurgia stereotassica che comporta l'impianto di più sonde fragili. Con l'aiuto della pompa ionica microfluidale, altre specie in molecole cariche potrebbero essere introdotte per trattare non solo l'epilessia, ma altre malattie neurologiche.
L'erogazione elettroforetica nell'interfacciamento tissutale presenta un nuovo approccio in generale per fornire specie in qualsiasi tessuto molle. Prestare particolare attenzione quando si applica il 4AP, poiché è una tossina e induce l'epilessia.
