Il modello TMEV è una delle prime piattaforme sperimentali a consentire lo studio dei meccanismi di sviluppo delle crisi convulsive come conseguenza dell'infezione del SNC. Le infezioni del SNC aumentano significativamente il rischio di epilessia. Questi modelli aiutano a identificare potenziali bersagli terapeutici e composti per i pazienti a rischio.
Gli sperimentatori dovrebbero essere addestrati a lavorare con i topi. L'iniezione del virus può essere praticata molto bene iniettando colorante in animali morti per ottenere sufficiente precisione e routine. A dimostrare la procedura sarà Laura Bell, una studentessa laureata del mio laboratorio.
Per iniziare, rimuovere il cappuccio della siringa da insulina e aggiungere un tubo di polietilene come collare attorno all'ago per garantire un'adeguata profondità di iniezione di 2,5 millimetri. Quindi immergere la siringa in etanolo per 30 minuti e posizionare la siringa sotto la luce UV per 30 minuti. Quindi, rimettere il cappuccio sull'ago e avvolgere la siringa in una sacca sterilizzante.
Fissare il sacchetto per chiuderlo ed etichettare con la data di preparazione. Per eseguire l'iniezione di virus, ottenere aliquote del ceppo Daniels di TMEV dal congelatore a meno 80 gradi Celsius. Scongelare il virus e tenerlo in ghiaccio.
Quindi caricare la siringa con la sospensione virale. Successivamente, pulire il banco con disinfettante e lavorare sotto un aspirafumi. Trasferire il topo anestetizzato dalla scatola di anestesia sotto il cappuccio e controllare la tolleranza chirurgica eseguendo un pizzico del piede.
Quindi pulire la testa dell'animale con un tampone imbevuto di alcool e inclinare leggermente la testa del topo verso sinistra in modo che il sito di iniezione sia rivolto verso l'alto. Tirare la pelle un po 'indietro e inserire l'ago nella testa. Quindi, iniettare 20 microlitri per via intracordica ad una profondità di 2,5 millimetri nella regione temporale dell'emisfero destro.
Lasciare la siringa in posizione per cinque-15 secondi e verificare eventuali perdite dall'iniezione o se si vedono bolle d'aria, quindi preparare una nuova siringa. Quando si estrae con attenzione la siringa, ruotarla leggermente. Quindi trasferire l'animale in una nuova gabbia, che viene posizionata metà su, metà fuori una piastra elettrica durante il recupero dall'anestesia.
E non lasciare gli animali incustoditi fino a quando non hanno riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la recumenza sternale. In primo luogo, portare tutte le gabbie al banco e osservare gli animali per le convulsioni due volte al giorno durante la fase di luce. Assegna un punteggio all'attività convulsiva in base a una scala di corsa modificata e riporta il numero e l'intensità delle convulsioni.
Quindi, fai scorrere una penna sulla gabbia per fare un po 'di rumore e trasferire ogni animale in un'altra scatola e viceversa. Per gli animali che non hanno afferrato spontaneamente o dopo un leggero scuotimento della gabbia, innescare le convulsioni con una manipolazione più intensa mentre si gira attentamente il topo capovolgendolo dalla coda da sinistra a destra. Osservare nuovamente ogni animale per il comportamento convulsivo e ripetere il processo per le gabbie successive.
Le convulsioni comportamentali sono state registrate se si sono verificate durante le iniezioni di droga o durante le successive sessioni di monitoraggio della gestione delle crisi. I dati osservati sono stati presentati come una mappa di calore creata immaginando le fasi di sequestro in diversi colori. Registrando l'EEG, vari eventi epilettici possono essere identificati nella fase cronica, mesi dopo l'infezione da TMEV.
La quantificazione della degenerazione ippocampale e dei topi epilettici infetti da TMEV mostra una significativa diminuzione dell'area ippocampale e un corrispondente aumento dell'area ventricolare dei topi TMEV rispetto ai controlli. L'analisi immunoistologica può fornire informazioni su vari parametri come la presenza di cellule infiammatorie. In questo caso, le sezioni contenenti l'ippocampo sono state colorate con anticorpi per marcare i linfociti T.
Gli animali finti infetti non mostrano infiltrazione di cellule T, mentre un'infiltrazione moderata è stata osservata nella maggior parte dei topi infetti da TMEV. Alcuni dei topi infetti mostrano una grave infiltrazione di linfociti T. Non tutti gli animali hanno convulsioni durante ogni periodo di osservazione.
Inoltre, la più alta incidenza di convulsioni si verifica nei giorni cinque e sei dopo l'inoculazione. Utilizziamo il modello TMEV per testare l'efficacia di nuovi farmaci anti-sequestro contro le crisi indotte da infezione. Possono anche essere valutati saggi che studiano i cambiamenti comportamentali di comorbilità e i cambiamenti elettrofisiologici.
Il modello TMEV ha fornito alla comunità di ricerca sull'epilessia il primo modello di epilessia indotto da infezione del SNC, consentendo lo studio dei meccanismi sottostanti dell'epilettogenesi dopo l'infezione.
