Quest'opera è stata in parte sostenuta da numeri di sovvenzione JSPS KAKENHI 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536 e 17 K 07086, numeri di sovvenzione MEXT KAKENHI 25110737 e 23110525, AMED Grant numero JP18ek0109311 e SENSHIN Medical Research Foundation e il Giappone Fondamento di ricerca di epilessia.

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di uso del Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science e cura degli animali. Postnatale 8 - 16-settimana-vecchi topi sono raccomandati. Qualsiasi ceppo inbred è accettabile per l'esperimento. Topi C57BL/6 sono più resistenti a PTZ, mentre topi albini BALB/c e svizzeri sono più sensibili a PTZ. C57BL/6 sono stati utilizzati in questo studio. Vulnerabilità di PTZ dipende anche dall'età del mouse. Rispetto ai più giovani topi, topi più vecchi sono più refrattari a PTZ35. Il numero di animali utilizzati per questo metodo può variare, ma almeno 6-10 animali sono necessari per ogni condizione.
1. preparazione di PTZ
<ol><li>Sciogliere 2 mg/mL PTZ in sterile 0,9% (p/v) NaCl. Preparare PTZ il giorno di utilizzo.</li>
</ol>2. iniezione di PTZ
<ol><li>Eseguire tutti gli esperimenti tra 9:00 e 12:00 (mezzogiorno).</li>
	<li>Misurare il peso corporeo dell'animale.</li>
	<li>Metti l'animale in una camera di osservazione per l'assuefazione.</li>
	<li>Durante il periodo di assuefazione (3 min), calcolare il volume di soluzione PTZ per l'iniezione basata sul peso corporeo dell'animale e la dose di iniezione precedentemente determinato. Nota: ad esempio, quando viene utilizzato 35mg/kg PTZ, 0,875 mg di PTZ è richiesto per un mouse pesa 25 g (35 mg / kg x 0,025 kg = 0.875 mg). Pertanto, deve essere iniettato 437.5 μL di soluzione di PTZ di 2 mg/mL (0.875 mg/2 mg / mL = 0,4375 mL). La dose di iniezione di PTZ dipende dal genotipo del mouse e ceppo. Per topi C57BL/6 di selvaggio-tipo, si raccomanda una dose di 30-35 mg PTZ/kg di peso corporeo per la prima prova. Sensibilità a PTZ dipende il mouse ceppo utilizzato36,37. La dose di iniezione varia secondo lo scopo dell'esperimento.</li>
	<li>Iniettare PTZ intraperitonealmente con una siringa 1 mL ad un ago calibro 27 nel quadrante destro o sinistro dell'addome dell'animale. Evitare di iniettare al midline.<ol>
<li>Evitare iniezioni ripetute nella stessa posizione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Osservare i comportamenti degli animali per 30 min dopo la somministrazione di PTZ (Figura 1A) e classificare e segnare il comportamento anormale, come illustrato di seguito. Se possibile, tenere gli animali sotto osservazione per 24 ore, o almeno un post-iniezione di altre 6-10 h, soprattutto una volta che raggiunge il Punteggio di severità di sequestro 3 o superiore.<ol>
<li>Nota qualsiasi lieve crisi epilettiche o cambiamenti comportamentali negli animali oltre il periodo di osservazione di 30 min. Questa prolungata osservazione periodo può rivolgere un effetto particolarmente importante e completo di una dose subconvulsive di PTZ nella generazione di grippaggi cronici non provocati nell'epilessia.</li>
		<li>Inoltre, misura la durata di sequestro di ogni grippaggio osservato come cambiamenti nella durata di sequestro riguardano la severità di sequestro. Inoltre, la latenza al primo sequestro dopo l'iniezione di PTZ è un'altra importante misura per raccogliere. Monitoraggio della frequenza delle crisi, la durata e la latenza è fondamentale per qualsiasi studio molecolare post-sequestro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniettare PTZ ogni altro giorno (Figura 1A). Il numero di iniezioni dipende l'obiettivo dell'esperimento. Esempi rappresentativi sono i seguenti.<ol>
<li>Per generare gli animali completamente accesi, una volta che un animale sperimenta un grippaggio con un punteggio di 5 (grippaggio tonico-clonic), finire l'iniezione all'interno di altre tre amministrazioni. In questo caso, aumentare la dose di iniezione se il Punteggio di sequestro non aumenta per tre amministrazioni consecutive. Ogni animale può ricevere un numero diverso e una dose di iniezioni di PTZ.</li>
		<li>Fissare il numero e la dose di iniezione PTZ in ogni condizione di valutazione della vulnerabilità per PTZ, compresi nelle valutazioni di farmaci anti-epilessia e studi del fenotipo di topi geneticamente modificati. Dare tutti gli animali lo stesso numero di iniezioni PTZ; un totale di 8-12 iniezioni è raccomandato. Se un animale muore, il Punteggio di sequestro deve essere indicato come 6.</li>
		<li>Determinare la dose di iniezione necessaria mantenere un sequestro elevato Punteggio ottenuto (4 o 5) per 10 o più iniezioni studiare i cambiamenti istopatologici che si verificano crisi epilettiche. In questo caso, il numero totale di iniezione dovrebbe variare da 25 a 30. Diminuire la dose di iniezione se raggiunge il Punteggio di sequestro 5. Se il Punteggio di sequestro si riduce a 3 o inferiore, aumentare la dose di iniezione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Punteggio di sequestro
<ol><li>Osservare i comportamenti animali e registrare i punteggi.<ol>
<li>Classificare e segnare i comportamenti epilettici come segue38,39 (Figura 1B): 0: comportamento normale, nessuna anomalia. 1: immobilizzazione, sdraiato sulla pancia. 2: testa annuendo, trattamento viso, degli arti anteriori o hindlimb mioclono. 3: continuo corpo intero mioclono, mioclonica cretini, coda tenuto ritto. 4: sequestro allevamento, tonica, cadendo su un fianco. 5: grippaggio tonico-clonic, cadendo sul dorso, selvaggio, correndo e saltando. 6: morte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Modificare i criteri comportamentali basati sul Racine Punteggio40, a seconda delle condizioni sperimentali.</li>
</ol>4. post-sequestro analisi
<ol><li>Immunohistopathological analisi<ol>
<li>Fissazione di perfusione<ol>
<li>Preparazione<ol>
<li>Paraformaldeide al 4% (p/v) (PFA) si dissolvono in 0.1 M tampone fosfato (pH 7,4). Riscaldare la soluzione a circa 70 ° C con l'aggiunta di una goccia di 1 M NaOH (circa 1 µ l di 1 M NaOH per 50 mL di soluzione PFA).</li>
				<li>Preparare 4 ghiacciata % PFA e tampone fosfato salino (PBS).</li>
				<li>Impostare una pompa peristaltica, con un tubo e un ago. Eseguire circa 20 mL di acqua attraverso il tubo per eliminare i residui. Quindi, posizionare l'estremità aperta del tubo in PBS ghiacciata.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Perfusione perfusione e preparazione del cervello fisso<ol>
<li>Profondamente anestetizzare il mouse con etanolo al 50% isoflurane/50% in un vasetto.</li>
				<li>Tenere il mouse in una posizione supina da appuntare le punte delle loro zampe anteriori e posteriori.</li>
				<li>Tagliare la linea mediana ventrale dell'addome ed esporre il diaframma.</li>
				<li>Tagliare il diaframma lungo il margine costale. Quindi, tagliare entrambi i lati laterali delle nervature e corpo. Pizzicare il processo xifoideo di pinza bloccante ed evert la gabbia toracica. Mantenere la posizione del processo xifoideo di blocco con un ago o che intrappola con il forcipe. Esporre il cuore.</li>
				<li>Inserire l'ago nel ventricolo di sinistra e fare un taglio nell'atrio di destra usando le forbici. Essere consapevoli di non spingere l'ago troppo lontano nel cuore, come può bucare un muro interno.</li>
				<li>Iniziare un flusso costante di PBS ghiacciata attraverso l'ago per lavare fuori il sangue (circa 15-20 mL/min).</li>
				<li>Quando il sangue è stato eliminato dal corpo, è possibile spostare il tubo ad una soluzione di paraformaldeide 4% (circa 60 mL) senza l'aggiunta di bolle. Quindi, arrestare la perfusione.</li>
				<li>Tagliare il collo posteriore e della colonna vertebrale e staccare la pelle di testa e la parte dorsale del cranio con forbici di dissezione.</li>
				<li>Tagliare l'osso premascellare tra le orbite oculari e rimuovere completamente la porzione dorsale del cranio.</li>
				<li>Creare un divario tra il cervello e l'osso jugal dal lato posteriore e tagliare i nervi di trigeminal e chiasm ottico sotto il cervello. Rimuovere il cervello con cautela e posizionarlo in un flaconcino contenente 4% PFA. Post-fissare il cervello a 4 ° C per 12-16 h.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparazione di fetta di cervello<ol>
<li>Trasferire il cervello fisso al saccarosio/PBS al 20% fino a quando il cervello si affonda nella soluzione per consentire crioprotezione.</li>
			<li>Tagliare il cervello fisso basato sull'orientamento richiesto fetta e la parte necessaria del cervello.</li>
			<li>Impostare il cryomicrotome. Impostare la lama in posizione e mantenere la fase microtomo a una temperatura inferiore a-20 ° C.</li>
			<li>Posizionate il cervello pre-tagliato sullo stage e rivestire il cervello con saccarosio/PBS al 20%. La soluzione di saccarosio/PBS congelerà gradualmente, che coprono il cervello sul palco, fino a quando il cervello è completamente immersa in congelati saccarosio/PBS al 20%.</li>
			<li>Affettare il cervello (30 µm di spessore) facendo scorrere la lama attraverso il tessuto. Trasferire le fette in PBS e tenerli a 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Immunohistochemistry fluorescente<ol>
<li>Lavare le fette necessarie nello 0,1% Triton X-100/PBS (PBST) per 10 min, 3 volte a temperatura ambiente (TA).</li>
			<li>Bloccare le fette di incubarle in PBST con 2% capra siero o 5% albumina di siero bovino (BSA) per 1-2 h a TA.</li>
			<li>Incubare le fette in una soluzione dell'anticorpo con l'adeguata concentrazione di anticorpo primario in PBST con 2% capra BSA siero o 5% per pernottamenti di 1 a 7 a 4 ° C.</li>
			<li>Lavare le fette in PBST per 10 minuti, 3 volte a TA.</li>
			<li>Incubare le fette in una soluzione di anticorpo secondario con l'adeguata concentrazione di anticorpo secondario in PBST per 1-2 h a RT, protetto da luce.</li>
			<li>Montare le fette su vetrini e coprite con mezzo di montaggio e copertura in vetro.</li>
			<li>Osservare le fette con microscopia di fluorescenza.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Tre-camera di prova<ol>
<li>Preparazione<ol>
<li>Preparare almeno 2 2-6-mese 129/Sv topi dello stesso sesso come i topi di soggetto di essere il "mouse Stranger". Habituate tutti i topi in gabbia prima dell'analisi. Per ogni sessione di allenamento, posizionare il mouse nella gabbia e lasciare il mouse per 15 min.</li>
			<li>Prima di ogni fase di assuefazione con il mouse di soggetto, pulire l'intero apparato ed entrambi gabbie strofinando la superficie con etanolo al 70%.</li>
			<li>Posizionare le gabbie vuote nelle camere di due laterali dell'apparecchio 3-alloggiamento e aprire le porte tra le camere.</li>
			<li>Habituate il mouse di soggetto, porre un mouse di soggetto nella camera centro e consentire il mouse per muoversi liberamente in tutta l'apparecchio fino a quando il mouse è studiato entrambi gabbie, più un animali oggetto di ulteriori 5 min che possono essere timorosi della gabbia non fanno indagare la gabbia per 20 minuti e non deve essere utilizzato per questa analisi. Tali animali evitare la gabbia e raramente vengono vicino alla gabbia.</li>
			<li>Dopo che l'animale si muove nella camera del centro, chiudere le porte e lasciare che il mouse muoversi liberamente nella camera centro per 5 min. Durante questo periodo, uno dei topi 129/Sv messo in una gabbia a habituate alla gabbia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analisi di socialità<ol>
<li>Eseguire questa analisi subito dopo il periodo di assuefazione del mouse oggetto.</li>
			<li>Posizionare la gabbia contenente un mouse 129/Sv, definito la "gabbia sconosciuto 1", in uno degli alloggiamenti laterali e posizionare la gabbia vuota, definita la "gabbia di oggetto", nel vano di lato.</li>
			<li>Aprire la porta e monitorare il comportamento del mouse oggetto.</li>
			<li>Consentire il mouse di soggetto di muoversi liberamente per 10 min e registrare i seguenti parametri comportamentali. Se il mouse soggetto ha paura del mouse nella gabbia 1 straniero, come indicato dal mouse evitando la gabbia 1 straniero e restanti nell'angolo di una delle camere, l'animale non deve essere utilizzato per l'analisi. a) tempo trascorso in ogni camera, camera di 1 straniero, l'oggetto camera e camera di centro. b) il tempo trascorso studiando ogni gabbia, gabbia 1 straniero e la gabbia di oggetto. (Il mouse è classificato come indagando la gabbia se il mouse è lo sniffing o toughing il mouse o la gabbia) c) il numero di ingressi in ogni camera (opzionale) d) totale distanza percorsa (opzionale)</li>
			<li>Dopo che il mouse si sposta nella camera del centro, chiudere le porte.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analisi sociale novità<ol>
<li>Eseguire questa analisi immediatamente dopo l'analisi di socialità.</li>
			<li>Pulire entrambi gabbie con etanolo al 70%.</li>
			<li>Posizionare un altro 129/Sv mouse in una delle gabbie, definite il "Stranger 2 gabbia" e posto l'estraneo 2 gabbia in uno degli alloggiamenti. Inserire il mouse 1 straniero nella gabbia, definita la "gabbia di Stranger 1" e la gabbia 1 straniero in altra camera.</li>
			<li>Aprire la porta e monitorare il comportamento del mouse oggetto.</li>
			<li>Consentire il mouse di soggetto di muoversi liberamente per 10 min e misurare gli stessi parametri del comportamento descritti per l'analisi di socialità. Nota: Il mouse 1 straniero e sconosciuto 2 dovrebbe essere scelto in modo casuale. Sconosciuto 1 camera e camera di oggetto nonché sconosciuto 1 sezione e sconosciuto 2 camera dovrebbe essere determinati in modo casuale.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Contestuale paura discriminazione<ol>
<li>Condizionata<ol>
<li>Prima di ogni prova condizionata, pulire l'apparato sperimentale strofinare la superficie con etanolo al 70%.</li>
			<li>Posizionare un mouse in un apparato condizionata con specifiche condizioni (apparato forma, colore della parete, materiale del pavimento, odore, illuminazione e volume di rumore di sfondo deve essere predeterminati). Ad esempio, l'apparato di condizionata usato qui era un apparecchio quadrato con pareti di plexiglass trasparente, un piano di griglia del metallo, un odore di etanolo, 100 lux di luminosità e rumore bianco sfondo 65-dB.</li>
			<li>Il mouse di circostanza di piede-scossa con tempismo pseudo-caso di 0,1-mA scosse elettriche per 2 s x 3 volte nel corso di 5 min.</li>
			<li>Tornare il mouse alla gabbia a casa dopo il condizionamento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Valutazione della memoria<ol>
<li>Prima di ogni valutazione, è necessario pulire l'apparato sperimentale strofinare la superficie con etanolo al 70%.</li>
			<li>Il giorno successivo seguente condizionata, posizionare il mouse sull'apparecchio stesso come condizione di scossa e misurare il tempo di congelamento nel corso di 5 min.</li>
			<li>Più tardi lo stesso giorno, posizionare il mouse in un apparato di romanzo e misurare il tempo di congelamento durante una valutazione di 5 min. Un apparato triangolare con pareti in plexiglass bianco, pavimento piatto, nessun odore, 30 lux di luminosità e rumore bianco 70-dB è stato usato qui.</li>
			<li>Confrontare il tempo di congelamento tra la stessa condizione e la condizione di romanzo. I topi con una capacità di memoria normale congelerà più nella stessa condizione che nella condizione di romanzo. Il congelamento è definito immobilità dell'animale per più di 2 s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Qui, presentiamo un protocollo ampiamente accessibile per l'istituzione di un modello animale farmacologico dell'epilessia. PTZ-mediata accensione chimica ha una lunga storia ed è un modello comunemente accettato per lo studio della patologia istopatologia e cellulare di epilessia41. Il modello di accensione chimica dell'epilessia è stato rivisto in precedenza da Suzdak e Jansen, 199542. L'induzione farmacologica sequestro, soprattutto con PTZ, è un metodo facile e sempl...

L'epilessia è una malattia neurologica cronica che è caratterizzata dai grippaggi ricorrenti e colpisce circa l'1% di persone. I meccanismi di generazione di epilettogenesi e sequestro nei pazienti di epilessia non possono essere completamente chiariti negli studi clinici. Di conseguenza, un modello animale adeguato è richiesto per lo studio dell'epilessia1.
Una varietà di modelli animali di epilessia sono stati utilizzati per studiare la fisiologia di epilessia e per identificare farmaci anti-epilettici2,3. Tra questi modelli, induzione farmacologica sequestro è un metodo comunemente utilizzato per generare un modello animale per lo studio della patologia di epilessia4. Questo metodo è poco costoso e semplice. L'accensione dell'elettrodo-mediata è anche un metodo comunemente usato, ma i costi di questa procedura sono superiori, e il metodo richiede competenze chirurgiche ed elettriche per indurre i grippaggi ripetitivo5.
Induzione farmacologica è vantaggiosa anche perché i tempi e il numero dei sequestri sono facilmente controllabili. Modelli genetici murini che presentano crisi epilettiche spontanee sono utilizzati anche nello studio dell'epilessia. Tuttavia, quando e quanto spesso i grippaggi derivano in questi modelli genetici di predizione può essere Impossibile6. Un sistema di monitoraggio è necessario per osservare il comportamento epilettico di topi geneticamente modificati6.
Acido kainic, pilocarpina e pentylenetetrazole (PTZ) sono ampiamente usati come d'induzione sequestro farmaci7. L'acido kainic è un agonista dei recettori del glutammato, e Pilocarpina attiva i recettori colinergici. PTZ è un acido gamma aminobutirrico (GABA)-un recettore antagonista8. PTZ sopprime la funzione delle sinapsi inibitorie, portando a un aumento dell'attività neuronale. Il presente regolamento fa sì che i grippaggi generalizzati in animali9. Una singola iniezione di acido kainic e Pilocarpina può indurre i grippaggi acuti, soprattutto lo stato epilettico (SE)10,11 e kainic acido o pilocarpina-mediata SE promuove cronica spontanea e ricorrente grippaggi12 , 13. analisi dei comportamenti e le registrazioni di electroencephalographic (EEG) hanno indicato che i grippaggi ricorrenti spontanei sono osservati un mese dopo una singola iniezione12,13. Una singola iniezione di una dose convulsiva di PTZ induce anche sequestro acuta. Tuttavia, crisi epilettiche spontanee croniche dopo una singola iniezione di PTZ sono difficili da promuovere. La somministrazione cronica di PTZ è necessaria per indurre i grippaggi ripetitivo14. In entrambi i metodi, la generazione dei sequestri ripetitivi è in grado di indurre una patologia più simile a quella dell'epilessia umana che la generazione di acuta crisi epilettiche. Nel caso di PTZ, ogni iniezione evoca un grippaggio e severità di sequestro diventa più grave in un modo graduale con ogni iniezione. Infine, una singola iniezione di PTZ della basso-dose induce un grippaggio tonico-clonic severo. In questa fase, ogni iniezione evoca i grippaggi severi. Inoltre, la latenza di grippaggio e la durata anche cambiare nel corso delle iniezioni. La latenza di grippaggio tonico diventa spesso più breve in quest'ultima fase di accensione15. Inoltre, aggravamento di grippaggio è accompagnato da un sequestro prolungata durata16. Indagando i meccanismi molecolari che regolano la severità di sequestro, latenza e la durata è utile per lo screening di farmaci anti-epilettici17,18,19.
I grippaggi sono comunemente indotti da una singola somministrazione sistemica di PTZ, e il recupero è molto veloce, entro 30 min4,5. Così, il numero dei sequestri è più controllabile nel modello PTZ-accendendo. Tuttavia, monitoraggio EEG ha indicato che picchi generalizzati possono essere visto fino a 12 ore dopo il sequestro di PTZ-mediata20. Pertanto, gli animali devono preferibilmente rimanere sotto osservazione per 24 h dopo le convulsioni miocloniche o tonic21 per un'analisi più precisa dei meccanismi di accensione.
La somministrazione di farmaci anti-epilettici, quali etosuccimide, valproato, fenobarbital, vigabatrin e retigabina3, prima o dopo l'iniezione di PTZ mitiga l'esasperazione del sequestro gravità3,22, 23. Allo stesso modo, topi knockout che mancanza geni coinvolti nell'esacerbazione di grippaggio, come matrix metalloproteinase-924, FGF-2225 e neuritin26, sono stati indicati per esibire la gravità ridotta sequestro dopo iniezioni multiple di PTZ. Inoltre, osservando alterazioni istopatologiche dopo i grippaggi epilettici è possibile con questo metodo. In pazienti con epilessia del lobo temporale, ci sono cambiamenti istologici tipici del cervello, come fibre muscose spuntano27,28, granello anormale del neurone migrazione29, astrogliosis30, un neurone delle cellule morte nell'ippocampo31,32e sclerosi hippocampal33. Simili cambiamenti sono osservati in animali modello epilettico. Tra i metodi disponibili, accensione chimica PTZ-mediata è un metodo buono, riproducibile e poco costoso per produrre un modello animale di epilessia. In un modello SE Pilocarpina-mediata, controllo delle crisi è difficile e molti topi muoiono o non riescono a svilupparsi SE34. Al contrario, la mortalità e la severità di sequestro sono più controllabili nel modello PTZ. Inoltre, PTZ è meno costoso di acido kainic e competenze in chirurgia del cervello del mouse non sono necessarie per l'amministrazione di droga.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pentylenetetrazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>MANAC</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse</td>
			<td>CLEA Japan</td>
			<td></td>
			<td>C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1mL)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle(27G x 3/4&#34;) (0.40 x 19 mm)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scale</td>
			<td>Mettler</td>
			<td>PE2000</td>
			<td>This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&#38;D company.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristatic pump</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>SJ1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>30404-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>REM-700</td>
			<td>This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>S35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-synaptoporin antibody</td>
			<td>Synaptic systems</td>
			<td>102 002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ZnT3 antibody</td>
			<td>Synaptic systems</td>
			<td>197 002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-doublecortin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8066</td>
			<td>This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contextual fear discrimination test apparatus</td>
			<td>O&#39;hara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three chamber test apparatus</td>
			<td>Muromachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pentylenetetrazole-induced kindling mouse model

Pentylenetetrazole (PTZ) è un antagonista del recettore GABA-A. Un'iniezione intraperitoneale di PTZ in un animale induce un acuto, grave sequestro a dosi elevate, mentre le iniezioni sequenziale di una dose di subconvulsive sono state utilizzate per lo sviluppo della chimica dell'accensione, un modello di epilessia. Una singola iniezione di basse dosi di PTZ induce una lieve crisi senza convulsioni. Tuttavia, ripetitivo della basso-dose iniezioni di PTZ diminuiscono la soglia per evocare un grippaggio convulsivo. Infine, la somministrazione continua di basse dosi di PTZ induce un grippaggio tonico-clonic severo. Questo metodo è semplice e ampiamente applicabile per studiare la fisiopatologia dell'epilessia, che è definita come una malattia cronica che coinvolge i sequestri ripetitivi. Questo prodotto chimico legnetti protocollo causa convulsioni ripetitive in animali. Con questo metodo, è stato stimato vulnerabilità alle crisi epilettiche PTZ-mediata o il grado di esasperazione dei grippaggi epilettici. Questi vantaggi hanno portato all'uso di questo metodo per lo screening di farmaci antiepilettici e geni correlati all'epilessia. Inoltre, questo metodo è stato utilizzato per studiare il danno neuronale dopo i grippaggi epilettici perché i cambiamenti istologici osservati nei cervelli dei pazienti epilettici appaiono anche nei cervelli degli animali ha acceso chimico. Così, questo protocollo è utile per produrre convenientemente modelli animali di epilessia.

Iniezione ripetuta di PTZ induce un aumento nella severità di sequestro. Sei topi C57BL/6 sono stati trattati con PTZ, e un altro 6 topi sono stati trattati con soluzione salina come gruppo di controllo. La dose PTZ era 35 mg/kg e 10 iniezioni sono state amministrate. Il Punteggio di grippaggio è aumentato gradualmente con iniezioni di PTZ, considerando che nessun grippaggi o comportamenti anormali sono stati evocati da iniezioni di soluzione salina (Figura 2</stron...

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Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Questo protocollo descrive un metodo di accensione chimica con pentylenetetrazole e fornisce un modello murino di epilessia. Questo protocollo è utilizzabile anche per indagare vulnerabilità per induzione di sequestro e patogenesi dopo crisi epilettiche nei topi.

Modello di topo indotta da pentylenetetrazole accensione

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

pentylenetetrazole-induced-kindling-mouse-model

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Neuroscience

Unit 1

Pharmacotherapy of the Epilepsies

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Video: Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-topo Imaging neuroanatomici Risonanza Magnetica

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

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Neuroscienze

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

Rilevazione di placche neuritiche nel modello di malattia di Alzheimer mouse

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages of using an IVSA paradigm to study the reinforcing properties of drugs of abuse such as cocaine include the fact that the drug is self-administered instead of experimenter-administered, the schedule of reinforcement can be altered, and accurate measurement of the quantities of drug consumed as well as the timing and pattern of IV injections can be obtained. Furthermore, the intravenous route of administration avoids potential confounds related to first pass metabolism or taste, and produces rapid increases in blood and brain drug levels. As outlined in this video, intravenous self-administration can be obtained without prior food restriction or prior drug training following careful catheter placement during surgery and meticulous daily catheter flushing and maintenance. Experimental procedures outlined in this paper include a description of animal housing and acclimation methods, operant training using sweetened milk solutions, and catheter implantation surgery.

The intravenous self-administration (IVSA) paradigm is considered to be the gold standard in examining the reinforcing properties of drugs of abuse in rodents. This manuscript outlines the experimental procedures and surgical techniques necessary to obtain reliable IVSA data. In particular, meticulous catheter implantation and maintenance are highlighted.

Metodi per l&#39;auto-somministrazione per via endovenosa in un modello murino

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex three-dimensional retinal blood vessels and capillaries by creating a two-dimensional flat-mount of the interconnected vascular channels after digestion of the non-vascular components of the retina. This allows one to study various pathologic vascular changes, such as microaneurysms, capillary degeneration, and abnormal endothelial to pericyte ratios. However, the method is technically challenging, especially in mice, which have become the most widely available animal model to study the retina because of the ease of genetic manipulations 6,7. In the mouse eye, it is particularly difficult to completely remove the non-vascular components while maintaining the overall architecture of the retinal blood vessels. To date, there is a dearth of literature that describes the trypsin digest technique in detail in the mouse. This manuscript provides a detailed step-by-step methodology of the trypsin digest in mouse retina, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Trypsin digest is one of the most commonly used methods to analyze retinal vasculature. This manuscript describes the method in detail, including key alterations to optimize the technique and remove the non-vascular tissue while preserving the overall architecture of the vessels.

Tripsina Digest protocollo per analizzare la vascolarizzazione della retina di un modello murino

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

Il corneale MICROPOCKET Assay: Un modello di angiogenesi nel Eye mouse

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

Misurare Progressive neurologico disabilità in un modello murino di sclerosi multipla

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Neurobehavioral Assessments in a Mouse Model of Neonatal Hypoxic-ischemic Brain Injury

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI brain injury by studying neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated (i.e., normal) mice. During the study, Rice-Vannucci&#39;s method was used to induce neonatal HI brain damage in postnatal day 7-10 (P7-10) mice. The HI operation was performed on the pups by unilateral carotid artery ligation and exposure to hypoxia (8% O2 and 92% N2 for 90 min). One week after the operation, the damaged brains were evaluated with the naked eye through the semi-transparent skull and were categorized into subgroups based on the absence (&#34;no cortical injury&#34; group) or presence (&#34;cortical injury&#34; group) of cortical injury, such as a lesion in the right hemisphere. On week 6, the following neurobehavioral tests were performed to evaluate the cognitive and motor functions: passive avoidance task (PAT), ladder walking test, and grip strength test. These behavioral tests are helpful in determining the effects of neonatal HI brain injury and are used in other mouse models of neurodegenerative diseases. In this study, neonatal HI brain injury mice showed motor deficits that corresponded to right hemisphere damage. The behavioral test results are relevant to the deficits observed in human neonatal HI patients, such as cerebral palsy or neonatal stroke patients. In this study, a mouse model of neonatal HI brain injury was established and showed different degrees of motor deficits and cognitive impairment compared to non-operated mice. This work provides basic information on the HI mouse model. MRI images demonstrate the different phenotypes, separated according to the severity of brain damage by motor and cognitive tests.

We performed unilateral carotid artery occlusion on postnatal day 7-10 CD-1 mouse pups to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of HI brain injury. We studied neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated normal mice.

Valutazioni di neurobehavioral in un modello murino di ferita di cervello Hypoxic-ischemica neonatale

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

In Vivo Imaging multimodale e l'analisi di Mouse indotta da Laser modello di Neovascularization coroidico

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

Il Hindbrain Mouse come modello di studio della neurogenesi embrionale

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

Preparation and Implantation of Electrodes for Electrically Kindling VGAT-Cre Mice to Generate a Model for Temporal Lobe Epilepsy

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique VGAT-Cre mice were used in developing spontaneous recurring seizures (SRS) after kindling and a likely mechanism - insertion of Cre into the VGAT gene - disrupted its expression and reduced GABAergic tone. The present study extends these observations to a larger cohort of mice, focusing on key issues such as how long the SRS continues after kindling and the effect of the animal's sex and age. This report describes the protocols for the following key steps: making headsets with hippocampal depth electrodes for electrical stimulation and for reading the electroencephalogram; surgery to affix the headset securely on the mouse's skull so that it does not fall off; and key details of the electrical kindling protocol such as duration of the pulse, frequency of train, duration of train, and amount of current injected. The kindling protocol is robust in that it reliably leads to epilepsy in most VGAT-Cre mice, providing a new model to test for novel antiepileptogenic drugs.

This report describes the methods to generate a model of temporal lobe epilepsy based on the electrical kindling of transgenic VGAT-Cre mice. Kindled VGAT-Cre mice may be useful in determining what causes epilepsy and for screening novel therapies.

Preparazione e impianto di elettrodi per l'accensione elettrica di topi VGAT-Cre per generare un modello per l'epilessia del lobo temporale

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique ...