Le procedure di prova della tossicità saranno dimostrate dal Dr. Ashok Aspatwar, un ricercatore senior del mio laboratorio. Il nostro protocollo identifica gli effetti off-target e rileva sottili effetti tossici delle sostanze chimiche nella fase iniziale di scoperta che potrebbero mancare nella coltura cellulare o in altri modelli animali. I principali vantaggi della nostra tecnica sono: è rapida ed efficiente, richiede una quantità molto piccola di sostanze chimiche e le strutture di base in laboratorio.
Lo screening tossico ci aiuterà a decidere la concentrazione per studiarne l'efficienza contro il micobatterio che causa la tubercolosi e per un ulteriore calcolo preclinico. Questo metodo utilizza approfondimenti sugli effetti off-target delle sostanze chimiche, e quindi questo metodo può essere utilizzato in qualsiasi area di ricerca in cui la tossicità della sostanza chimica è di primaria importanza. Questo metodo è molto semplice e può essere eseguito da chiunque senza esperienza precedente.
Gli individui senza esperienza dovrebbero pianificare attentamente l'esperimento e utilizzare un solo composto. Questo metodo fornisce effetti tossici delle sostanze chimiche sotto forma di cambiamenti fenotipici negli embrioni di zebrafish in via di sviluppo e quindi sicurezza dei composti testati. Per iniziare, posiziona da due a cinque zebrafish maschi adulti e da tre a cinque zebrafish femmine adulte in vasche di accoppiamento durante la notte.
Al mattino, accendere la luce mentre l'allevamento è indotto dal ciclo automatico buio e luce successivo. Per evitare di maneggiare lo stress per gli animali, consentire agli animali di riposare per due settimane prima di utilizzare gli stessi individui per la riproduzione. Il giorno successivo, prima di mezzogiorno, raccogliere gli embrioni utilizzando un colino a rete fine e trasferirli su una piastra di petri contenente mezzo embrionale E3.
Posizionare la piastra di Petri al microscopio stereo per esaminare ogni lotto di embrioni. Identificare l'aspetto opaco e rimuoverli come embrioni non fecondati o morti. Mantenere gli embrioni a 28,5 gradi Celsius in un'incubatrice durante la notte.
La mattina seguente, esaminare gli embrioni al microscopio stereo e rimuovere eventuali embrioni malsani o morti. Utilizzare con cura una pipetta pasteur per trasferire un embrione in ogni pozzo di una piastra di 24 pozza. Assicurarsi che ogni pozzo contenga abbastanza mezzo E3 per coprire gli embrioni.
Eseminare le fiale contenenti composti inibitori conservati a 4 gradi Celsius in frigorifero. Utilizzare una bilancia analitica per pesare la quantità appropriata del composto e preparare 250 microlitri di soluzione di 100 millimolare per ogni composto in mezzo E3 o in un altro solvente appropriato. Quindi, utilizzare il mezzo E3 per effettuare diluizioni seriali delle soluzioni stock in base ai livelli di tossicità in tubi di centrifuga da 15 millilitri.
Dai pozzi che contengono ciascuno un embrione DPF, utilizzare una pipetta pasteur e una pipetta da 1 millilitro per rimuovere l'acqua E3 una riga alla volta. Distribuire immediatamente 1 millilitro di ogni diluente delle soluzioni stock nei pozzi della piastra del pozzo 24 partendo da una concentrazione inferiore e passando a una concentrazione più elevata. Per i gruppi di controllo, aggiungere acqua E3 o un altro solvente pertinente.
Etichettare 24 piastre di pozzo con il nome e la concentrazione del composto e mantenere le piastre a 28,5 gradi Celsius in un'incubatrice. Fare attenzione che i diluitanti delle sostanze chimiche nei pozzi non siano evaporati nell'incubatrice sigillando i lati di 24 piastre del pozzo. Ventiquattro ore dopo l'esposizione dei composti chimici, utilizzare una pipetta pasteur per trasferire le larve esposte ad ogni concentrazione del composto in una piccola piastra di Petri contenente cellulosa metile ad alto peso molecolare del 3%.
Con una sonda metallica, appoggiala lateralmente. Posizionare la piastra di Petri sotto un microscopio stereo collegato a una fotocamera. Prendi le immagini e salva le immagini in una cartella separata ogni giorno fino alla fine dell'esperimento.
Immettere tutte le osservazioni in una tabella ogni giorno in una tabella online o su un foglio stampato. Per l'esposizione a composti neurotossici, le larve da quattro a cinque DPF possono mostrare un modello di nuoto anomalo. In tal caso, registra tali modifiche catturando un breve video da 30 secondi a un minuto delle larve.
Dopo cinque giorni di esposizione ai composti chimici, si noti la concentrazione alla quale la metà degli embrioni muore come la concentrazione letale semi massima 50 di ciascuna sostanza chimica. Costruire una curva per la mortalità degli embrioni per tutte le concentrazioni utilizzando un programma adatto. In questo protocollo, la parte critica della valutazione della tossicità è testare diverse concentrazioni di uno o più composti chimici in un singolo esperimento.
Per i composti che inducono eventuali difetti fenotipici nelle larve, i difetti sono stati registrati ogni 24 ore nel periodo da uno a cinque giorni dopo l'esposizione alla sostanza chimica. Gli embrioni trattati con inibitori beta CA alle concentrazioni di 250 micromolari e 125 micromolari presentano vari difetti fenotipici rispetto al controllo. Ad esempio, embrioni non occorsi anche al giorno 3, struttura del corpo curva, sacco tuorlo nonutilizzato ed edema pericardico e assenza di sacche di otolito nelle larve a cinque giorni dal trattamento.
In un altro studio, gli embrioni trattati con inibitori della CA hanno mostrato l'assenza di sacche di otoliti e vescica da bagno. Gli esperimenti hanno identificato un composto rappresentativo dell'anidrasi carbonica 9, che ha indotto cambiamenti fenotipici minimi o nulla durante lo sviluppo embrionale a 500 micromolari. Il composto ha mostrato un'alta concentrazione di LC50.
Tuttavia, in un confronto con un controllo, lo stesso composto a 300 micromolari è stato trovato neurotossico e atassia indotta nelle larve dopo cinque giorni di esposizione. Una buona qualità degli embrioni è importante per lo screening tossico delle sostanze chimiche. Per ottenere embrioni di buona qualità, utilizzare giovani coppie di zebrafish adulti per l'allevamento.
I composti che emergono come sicuri possono essere ulteriormente caratterizzati dall'esecuzione di rilevanti esperimenti in vitro e in vivo. Nel campo dello sviluppo di farmaci antitubercolosi, questa tecnica ha contribuito a creare ulteriori esperimenti per l'inibizione in vivo del micobatterio marinum negli embrioni di zebrafish. Il protocollo prevede l'uso di sostanze chimiche che possono essere tossiche per l'uomo.
Le persone coinvolte negli esperimenti dovrebbero prestare la dovuta attenzione quando maneggiano le sostanze chimiche.
