Questo protocollo è utile per caratterizzare le funzioni di assemblaggio dei complessi di secrezione batterica e può portare a una comprensione fondamentale dei meccanismi molecolari necessari per le interazioni patogene ospiti. Questa tecnica integra approcci complementari che preservano la struttura nativa del campione e consentono e vedono la visualizzazione di complessi di proteine in cellule batteriche intatte. Aumenta la nostra comprensione delle relazioni di funzione strutturale dei sistemi di secrezione batterica.
Questo metodo può essere adattato per studiare altri tipi di sistemi di secrezione o altri complessi cellulari in un'ampia varietà di specie batteriche. Inizia realizzando cuscinetti di agarosio per l'imaging di cellule vive. Preparare circa 30 ml di soluzione di agarosio a fusione bassa dell'1% in acqua e microonde in un pallone di vetro per circa 90 secondi girandolo di tanto in tanto fino a quando l'agarosio non viene completamente sciolto.
Posizionare due vetrini da 22 per 22 per 0,15 mm sul bordo di uno scivolo di vetro da 25 per 75 per 1,1 mm uno sopra l'altro. Quindi, impila altre due diapositive più piccole sull'altro bordo. Pipettare circa 1 mL dell'agarosio fuso nello scivolo centrale tra i due vetri superiori e posizionare un altro grande scivolo sopra l'agarosio fuso assicurandosi di evitare la formazione di bolle d'aria.
Raffreddare gli scivoli a quattro gradi Celsius per 15 minuti, quindi utilizzare un bisturi o una lama di rasoio per tagliare delicatamente il pad in piccoli quadrati. Fissare un telaio adesivo a doppia parte su uno scivolo di vetro da 25 per 75 per 1,1 mm e posizionare diversi cuscinetti sullo scivolo. Sciogliere una pesante macchia di Legionella Pneumophila in 1 mL di acqua doppia distillata.
Quindi vortice e pipetta da due a tre microlitri della diluizione sui cuscinetti. Posizionare delicatamente un coperchio 58 per 24 per 0,15 mm scivolare sul telaio adesivo. Selezionare le celle per l'imaging utilizzando l'illuminazione a campo luminoso.
Quindi, nella finestra di acquisizione del software del microscopio, regolare l'ND a 180 e il binning a due per due. Utilizzare il canale di 488 nanometri per esporre il campione per 500-1000 millisecondi e convalidare la specificità della fluorescenza imaging della Legionella Pneumophila non registrata con gli stessi parametri. Per quantificare la polarità, regolare il contrasto dell'immagine in modo che i batteri siano chiaramente visibili.
Quindi ingrandire la regione di interesse e utilizzare lo strumento regione per posizionare un rettangolo di 0,25 per 1,3 micrometri partendo dal polo e estendendosi nel citoplasma assicurandosi che il rettangolo rimanga all'interno dei bordi batterici. Contrassegnare almeno 200 batteri e creare maschere utilizzando la regione per mascherare il pulsante nel menu analizza. Fare clic sulle statistiche della maschera e scegliere l'oggetto nell'ambito della maschera.
Quindi contrassegnare l'intensità media e la varianza sotto le caratteristiche e l'intensità. Esportare i dati come file di testo e utilizzare l'applicazione foglio di calcolo per calcolare i punteggi di polarità di ciascun batterio come rapporto tra la varianza e l'intensità media. Per applicazioni ad alta produttività utilizzare la microscopia a contrasto facciale per acquisire immagini a doppio canale.
Assicurati di scegliere i campi visivo in cui i batteri sono completamente separati. Quindi, regolare il contrasto del canale facciale dell'immagine a un livello in cui i batteri sono chiaramente visibili. Aprite l'immagine a doppio canale e avviate la finestra crea maschera segmento.
Regolare la soglia appropriata, quindi rimuovere gli oggetti di piccole dimensioni facendo clic sul pulsante definisci oggetti e regolando la dimensione minima a 100 pixel. In maschera di affinamento selezionare rimuovi oggetti bordi e maschere separate di batteri adiacenti l'uno all'altro. Per quantificare la dinamica delle proteine di fusione, aprire la finestra di acquisizione dell'immagine e segnare il time lapse.
Immettete due nella casella numero di punti di tempo. Acquisisci due immagini di successo di Legionella Pneumophila che esprimono la proteina fluorescente di interesse. Regolare il contrasto dell'immagine fino a quando le celle non sono chiaramente visibili.
Quindi utilizzare lo strumento regione per posizionare un quadrato di 0,25 per 0,25 micrometri al centro di almeno 400 celle. Quindi, usate il pulsante area per mascherare nel menu analizza per creare una maschera dei quadrati di interesse. Creare una nuova maschera vuota e utilizzare lo strumento pixel per contrassegnare l'intera area della cella di almeno 25 celle casuali.
Create un'altra maschera e usate lo strumento pennello di grandi dimensioni per contrassegnare le aree tra le celle. Infine, selezionare le statistiche della maschera e assicurarsi che l'oggetto sia selezionato nell'ambito della maschera per la maschera uno. Sotto caratteristiche e intensità, scegli l'intensità media.
Esportare i dati e ripetere il processo per la maschera 2. Per la maschera 3, selezionare l'intera maschera ed esportare l'intensità media. Per preparare il campione di criotomografia elettronica, far crescere una pesante macchia di Legionella Pneumophila sulle piastre CYE Agrastreptomisum per 48 ore a 37 gradi Celsius.
Resuspend le cellule in acqua ad un OD 600 di circa 0,7. Quindi aggiungere cinque microlitri di particelle di oro colloidale a 20 microlitri della sospensione cellulare. Glow scarica una griglia di carbonio holey e pipetta cinque microlitri della miscela cellulare su di esso.
Lascialo riposare per un minuto. Asciugare la griglia con carta da filtro e congelarla in etano liquido utilizzando un apparato pistone azionato dalla gravità. Dopo aver inserito la supercartella GFP nel cromosoma Legionella Pneumophila, è stata eseguita una microscopia fluorescente a cellule vive per confrontare il segnale fluorescente con quello del ceppo negativo GFP della supercartella parentale.
Inoltre, la microscopia a campo luminoso è stata utilizzata per esaminare la proporzione di cellule con uno specifico segnale fluorescente. Solo una frazione delle cellule che producevano la supercartella DotB GFP mostrava la localizzazione polare della proteina di fusione. Quando si caratterizza la distribuzione del segnale fluorescente DotB, si è scoperto che l'intensità della supercartella DotB GFP ai poli era circa due volte superiore a quella del citosolo.
Per verificare se la localizzazione polare GFP della supercartella DotB dipendeva da un sistema di secrezione di tipo quattro completamente assemblato, i punteggi di polarità della supercartella DotB GFP erano determinati per le singole cellule in un tipo selvaggio e in un mutante del sistema di secrezione di tipo quattro. In effetti, il posizionamento polare della supercartella DotB GFP è scomparso quando il sistema Dot/ICM è stato eliminato. I modelli dinamici indicavano che il DotB ATPasi era presente in una popolazione citosolica dinamica ed è stato reclutato nel sistema di secrezione localizzato polare Dot/ICM di tipo quattro in una reazione di assemblaggio in fase avanzata.
Il crio-ET ad alta produttività è stato utilizzato per visualizzare l'apparato intatto del sistema di secrezione di tipo quattro in un ceppo legionella Pneumophila che esprime la supercartella DotB GFP. La ricostruzione della cella ha rivelato più macchine Dot/ICM incorporate nell'involucro della cella. È stato anche determinato il posizionamento complessivo di DotB e della supercartella GFP in relazione alla macchina del sistema di secrezione di tipo quattro intatta.
I rendering tridimensionali della superficie indicavano che la supercartella GFP è posizionata sotto l'esamero DotB, che si assembla come un disco alla base del complesso citoplasmatico ATPasi. Quando si tenta questa tecnica, assicurarsi di valutare la stabilità delle proteine di fusione e la funzionalità del sistema di secrezione di tag prima di procedere all'acquisizione dell'immagine. La modellazione e il raccordo possono essere modi efficaci per analizzare i modelli dinamici e le densità strutturali, nonché per la valutazione dei cambiamenti conformazionali o la localizzazione delle subunità nella struttura.
Questo approccio può aiutare a capire come funzionano diversi componenti di sistema segreti di tipo quattro, come interagiscono all'interno del complesso maggiore e quali funzioni svolgono diversi sottoassiemi.
