La sintesi proteica è soggetta a errori. Tuttavia, gli errori possono essere adattivi sotto stress fisiologico. In precedenza abbiamo dimostrato che errori di traduzione specifici nel micobatterio sono fattori che contribuivano alla tolleranza agli antibiotici.
Essere in grado di misurare tassi di errore specifici ci consente di indirizzare questo meccanismo adattivo ai batteri. I principali vantaggi di queste tecniche sono che i giornalisti a guadagno di funzione possono essere squisitamente sensibili nel misurare piccoli tassi di errore che non sono facili da rilevare con la spettrometria di massa. Il test Nluc/GFP consente lo screening della produttività media poiché evita un'eccessiva manipolazione e llisi dei batteri.
A dimostrare la procedura sarà lo studente di dottorato Yue-Meng Chen. Oggi dimostreremo la procedura di utilizzo di questi due giornalisti attraverso questo video. Per cominciare, inoculare due millilitri di mezzo 7H9 con ceppi di reporter micobatterici di tipo selvaggio e mutato.
Agitare a 37 gradi Celsius per uno o due giorni o fino a quando l'OD a 600 nanometri raggiunge la fase stazionaria. Aliquota e diluire per ottenere un OD a 600 nanometri intorno a 0,5 a 1. Quindi, aggiungere ATC a una concentrazione finale di 50 nanogrammi per millilitro.
Aggiungere immediatamente diverse dosi di ksg alla coltura in base al manoscritto per misurarne gli effetti sui tassi di traduzione errata. Incubare a 37 gradi Celsius con scuotimento per quattro o sei ore. Successivamente, trasferire le colture batteriche in un tubo da due millilitri.
E centrifugare a 3.220 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti per pellettare i batteri. Dopo la fase di centrifugazione, scartare il supernatante e interrompere i batteri aggiungendo 40 microlitri di tampone di lisi passiva 1x. Trasferire il lysate batterico rimsorsi su una piastra bianca da 96 po ', un pozzo per campione, e agitare a temperatura ambiente per 20 minuti.
Aggiungere 80 microlitri di substrato di lucciola ad ogni pozzo. Agitare per 15 secondi e misurare la luminescenza di un luminometro. Quindi, aggiungere 80 microlitri di substrato di Renilla ad ogni pozzo.
Agitare per 15 secondi e misurare la luminescenza dal luminometro. Utilizzare i valori corretti per calcolare i tassi di traduzione errata di ogni condizione. Per iniziare, inoculare due millilitri di mezzo 7H9 con il ceppo reporter batterico.
Agitare a 37 gradi Celsius per uno o due giorni o fino a quando l'OD a 600 nanometri raggiunge la fase stazionaria. Quindi, la sottocoltura in 50 millilitri di mezzo 7H9 e crescere fino a quando l'OD a 600 nanometri raggiunge la fase stazionaria tardiva. Prima di aliquotare i batteri su una piastra da 96 pozzetti, aggiungere ATC a una concentrazione finale di 50 nanogrammi per millilitro e mescolare bene.
Aggiungere 100 microlitri per pozzo a una piastra chiara a fondo rotondo da 96 po'. Successivamente, aggiungere diverse dosi di ksg ai pozzi selezionati per schermarne gli effetti sui tassi di traduzione errata. Aggiungere 200 microlitri di acqua sterile ai pozzi di bordo della piastra per limitare l'evaporazione dai pozzi del campione.
Sigillare la piastra, agitare e indurre i campioni a 37 gradi Celsius per 16-20 ore. Utilizzare una pipetta multicanale per prescivole 80 microlitri da ogni pozzo. Trasferire i campioni su una piastra a 96 po' dal fondo nero e misurare il segnale GFP dal luminometro.
Dopo aver misurato il segnale GFP, centrifugare la piastra a 3.220 volte g per 10 minuti. Quindi, trasferire 50 microlitri del supernatante su una piastra bianca da 96 porri. Quindi, aggiungere 50 microlitri di substrato Nluc ad ogni pozzo.
Mescolare bene e misurare la luminescenza dal luminometro. Infine, determinare il rapporto Nluc/GFP dividendo il valore corretto della luminescenza di Nluc per la fluorescenza GFP. In questo lavoro, il sistema di reporter di lucciola Renilla è stato utilizzato per misurare il tasso di traduzione errata in presenza di kasugamicina in tipo selvaggio e in un ceppo di S.Smegmatis che ksgA è stato eliminato.
I risultati hanno mostrato un chiaro modo dose-dipendente di ksg diminuendo il tasso di traduzione errata mentre nel ceppo di cancellazione ksgA, ksg era meno potente e la linea di base del tasso di traduzione errata era più alta a causa della resistenza alla modulazione da kasugamicina. L'azione della kasugamicina sulla traduzione errata è stata misurata anche utilizzando il reporter Nluc/GFP. Sia renilla lucciola che giornalista Nluc/GFP comportano la misurazione dell'attività della luciferasi.
Piccoli errori di pipettazione potrebbero causare grandi fluttuazioni nelle letture. Per cominciare, ti consigliamo di aumentare il numero di ogni replica per ridurre al minimo la possibilità di ottenere letture inaffidabili.
