Lo scopo di questo metodo è identificare la connettività funzionale degli input a lungo raggio provenienti da regioni cerebrali lontane utilizzando la fotostimolazione nelle fette cerebrali. Il targeting stereotassico di una specifica regione cerebrale per varie espressioni mediate di canali ionici sensibili alla luce consente la stimolazione selettiva di assoni provenienti da quella regione con la luce. A dimostrare la procedura sarà Louis Richevaux, un dottorando del mio gruppo.
Prima dell'intervento chirurgico, verificare che l'animale sia ben anestetizzato con un dito del piedi. Estrarre delicatamente la lingua per facilitare la respirazione. Quindi, radersi i capelli cranici.
Iniettare 20 microlitri di cloridrato di lidocaina sotto la pelle della testa per l'anestesia locale e attendere cinque minuti. Per esporre il cranio, fai un taglio sul cuoio capelluto. Quindi, posizionare l'animale in una cornice stereotassica.
Inserire le barre dell'orecchio e appoggiarle sulle ossa leggermente rostrali alle orecchie e tirare giù la pelle per creare un buon accesso al cranio. Stringere le barre dell'orecchio e installare il nasello. Mantenere il corpo dell'animale orizzontalmente e a livello della testa utilizzando un supporto regolato in altezza.
Posizionare una pastiglia riscaldante sotto l'animale per mantenerla a temperatura fisiologica. Quindi pulire il cranio applicando lo 0,9% di cloruro di sodio con un batuffolo di cotone per rimuovere i tessuti molli. Regolare il cranio in modo che l'accesso alla bregma lambda sia livellato.
Quindi, individuare il sito di iniezione sul cranio in base alle coordinate posteriori e mediali e posizionare l'ago di iniezione sopra di esso. Segna il cranio con un ago usa e getta. Successivamente, spostare l'ago di iniezione verso l'alto di quattro centimetri.
Utilizzando una bava di 0,5 millimetri, creare una craniotomia di un millimetro di diametro sul segno a metà della velocità massima. Tampone con un tessuto in caso di sanguinamento. Quindi, svuotare l'acqua contenuta nella siringa Hamilton per la conservazione espellendola completamente con una pompa.
Solo l'ago è pieno d'acqua. Scongelare la soluzione virale da iniettare sul ghiaccio, quindi rimuoverla brevemente dal ghiaccio e ottenere 700 nanolitri della soluzione con una micropipetta. Quindi, deposita una goccia su un pezzo di pellicola di paraffina.
Posizionare il film di paraffina sopra la craniotomia. Immergere l'ago nella goccia di soluzione virale senza cambiare l'anteroposterior e la posizione laterale. Successivamente, utilizzare la funzione di ritiro della pompa per riempire la siringa con circa 500 nanolitri della soluzione virale sul film di paraffina.
Eseguire questa procedura sotto lo stereoscopio, guardare la goccia scomparire e assicurarsi di non aspirare aria. Assicurarsi che la siringa sia stata riempita correttamente. Testare il sistema di espulsione guidando verso il basso lo stantuffo per testare espellere una piccola goccia di liquido.
Successivamente, inserire l'ago nel cervello alla profondità scelta. Premere il pulsante esegui per l'iniezione. Quindi, ritirare lentamente l'ago per tre o cinque minuti.
Lavare immediatamente l'ago in acqua distillata pulita riempiendolo più volte per evitare l'intasamento. Successivamente, rimuovere l'animale dal telaio stereotassico. Suturare la pelle e fare tre o quattro punti legati con 2-1-1 nodi chirurgici standard.
Per estrarre il cervello, fare un taglio sulla pelle dal collo al naso, quindi sessare le ultime vertebre dal cranio con le forbici. Ritrarre la pelle e tagliare il cranio lungo la linea mediana dalla direzione caudale a quella rostrale. Rimuovere con cura l'osso parietale e la parte caudale dell'osso frontale.
Estrarre il cervello con una piccola spatola arrotondata inserendolo tra il cervello e il pavimento cranico, separando il bulbo olfattivo, il nervo ottico e altri nervi cranici e cervelletto. Immergere delicatamente il cervello in una soluzione di taglio a freddo ghiacciato. Successivamente, trasferire il cervello su una carta da filtro e asciugare delicatamente la superficie corticale.
Incollare la corteccia cerebrale al portacampioni di un vibratoma con il lato caudale rivolto verso la lama al fine di tagliare le fette cerebrali orizzontali. Quindi, riempire la camera di taglio con una soluzione di taglio ossigenata ghiacciata in modo che il cervello sia completamente immerso. Sezione 300 micrometri fette spesse con il vibratoma ad una velocità di 07 millimetri al secondo ad un'ampiezza millimetra.
In questa fase, si consiglia di controllare brevemente l'espressione Chronos-GFP nel talamo utilizzando una torcia fluorescente e i corrispondenti occhiali filtranti. Per eseguire la registrazione patch-clamp a celle intere, trasferire delicatamente una fetta cerebrale contenente il complesso ippocampale alla camera di registrazione. Perfonde continuamente la camera di registrazione con 34 gradi Celsius ACSF bolleto con carbogeno a due o tre millilitri al minuto.
Esaminare brevemente l'espressione Chronos-GFP nei terminali axon nella regione di interesse con illuminazione a LED blu con ingrandimento 4X. Passare a un obiettivo di immersione 63X e regolare la messa a fuoco. Verificare la presenza di assoni che esprimono Chronos-GFP e scegliere un neurone piramidale per la registrazione delle patch.
Quindi, riempire una pipetta con soluzione interna a base di gluconato di potassio. Montarlo nel supporto della pipetta sul palco della testa. Applicare patch alla cella nella configurazione del morsetto di tensione.
Avvicinati al neurone identificato e premi delicatamente la punta della pipetta sul soma. La pressione positiva dovrebbe produrre una fossette sulla superficie della membrana. Quindi, rilasciare la pressione per creare una guarnizione gigoOm.
Una volta sigillata, impostare la tensione di tenuta su meno 65 millivolt. Rompere la membrana con un forte impulso di pressione negativa. Registrare le risposte del neurone ai passaggi di corrente iperpolarizzanti e depolarizzanti in modalità clamp di corrente intera cellulare.
Registrare nelle risposte postsinaptiche del morsetto di corrente o tensione alla stimolazione a led a led da 475 nanometri di fibre afferenti che esprimono Chronos. Stimolare con treni di dieci stimolazioni della durata di due millisecondi a 20 hertz. L'attività dei neuroni presubicolari nello strato tre in risposta ai passaggi di corrente iperpolarizzanti e depolarizzanti è stata registrata nella configurazione patch-clamp a cellule intere.
Stimolando i terminali di assone ADN che esprimono Chronos-GFP ha suscitato potenziali eccitatori post-sinaptici nello strato presubicolare tre cellule principali in modalità clamp corrente. A seconda dell'intensità della luce, gli EPS potrebbero raggiungere la soglia potenziale d'azione. Le risposte post-sinaptiche sono state osservate anche in modalità clamp di tensione, poiché sono state suscitate correnti eccitatorie post-sinaptiche.
Qui è mostrato uno strato tre neuroni piramidali circondati da assoni talamici che esprimono Chronos-GFP in strati superficiali presubicolari con colorazione DAPI immagine con un microscopio a epifluorescenza. E questa immagine è stata scattata ad un ingrandimento più elevato con un microscopio confocale. Un attento livellamento del bregma lungo l'asse nell'esecuzione di esperimenti pilota con un tracciante fluorescente è fondamentale per migliorare la precisione dell'iniezione stereotassica.
Questa procedura può anche essere utilizzata per indagare proiezioni convergenti da aree diverse iniettando in due scene generative sensibili a due diverse lunghezze d'onda. Lo sviluppo di questa tecnica ha permesso una precisa analisi anatomica e funzionale del circuito tra regioni cerebrali distanti in modo specifico di tipo cellulare.
