I cambiamenti mitocondriali svolgono un ruolo importante nei tumori ovarico umani. Questo protocollo stabilisce una piattaforma efficace per isolare e purificare i mitocondri dal cancro ovarico umano e dai tessuti di controllo per l'analisi della proteomica su larga scala. I mitocondri, come centri di metabolismo energetico, segnalazione cellulare e stress ossidativo, la comprensione dei cambiamenti del proteoma mitocondriale nei tumori ovarico beneficiano della nostra comprensione del meccanismo molecolare, ed è una scoperta di biomarcatori efficaci e degli obiettivi terapeutici.
Questa tecnica utilizza la centrifugazione a velocità differenziale in combinazione con la centrifugazione del gradiente di densità per separare i mitocondri dal cancro ovarico umano nei tessuti di controllo, il che si traduce in campioni di mitocondri di alta qualità per l'analisi quantitativa della proteomica. La preparazione dei mitocondri, insieme alla proteomica quantitativa iTRAQ, è stata utilizzata con successo nell'analisi del tessuto tumorale ovarico umano, che si traduce facilmente per analizzare altri tessuti, la proteomica dei mitocondri. Coloro che non hanno mai eseguito questo metodo possono scoprire che può essere difficile isolare i mitocondri dal controllo ovarico rispetto ai tessuti tumorali.
È necessario aggiungere una tripina per migliorare l'omogeneizzazione dei tessuti di controllo e aggiungere uno strato aggiuntivo di mezzo gradiente di densità per migliorare la separazione dei mitocondri. Per iniziare questa procedura, preparare 250 millilitri del buffer di isolamento mitocondriale come delineato nel protocollo di testo. Mettere circa 1,5 grammi di tessuti tumorali ovariani in un piatto di vetro pulito.
Aggiungere due millilitri di tampone di isolamento mitocondriale pre-refrigerato per lavare leggermente il sangue dalla superficie del tessuto. Ripetere questo lavaggio tre volte. Quindi, utilizzare forbici oftalmiche pulite per tritare completamente il tessuto in pezzi che sono di circa un millimetro cubico e trasferire i tessuti tritati in un tubo di centrifuga da 50 millilitri.
Aggiungere 13,5 millilitri di tampone di isolamento mitocondriale contenente nagarse ad una concentrazione di 0,2 milligrammi per millilitro. Utilizzare un omogeneizzatore elettronico per omogeneizzare i tessuti tritati per due minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, aggiungere altri tre millilitri di tampone di isolamento mitocondriale agli omogeneati tissutali e mescolarli bene pipettando.
Centrifugare il tessuto preparato omogeneizzato a 1.300 xg e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere il pellet e mantenere il supernatante. Quindi, centrifuga il supernatante a 10.000 xg e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Rimuovere il supernatante contenente microsomi e mantenere il pellet. Aggiungere 2 millilitri di tampone di isolamento mitocondriale e sospendere accuratamente il pellet mediante pipettazione leggera. Centrifuga questa sospensione a pellet a 7.000 xg e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Scartare il supernatante e mantenere il pellet, che contiene i mitocondri grezzi. Aggiungere 12 millilitri di mezzo gradiente di densità del 25% per sospendere di nuovo i mitocondri grezzi estratti. Creare un gradiente di densità discontinuo contenente i mitocondri grezzi ri-sospesi come delineato nel protocollo di testo e centrifugarlo a 52.000 xg e a quattro gradi Celsius per 90 minuti.
Utilizzare una siringa lunga e smussata per raccogliere i mitocondri purificati all'interfaccia tra i mezzi gradienti del 25% e del 30% e trasferirli in un tubo pulito. Aggiungere il tampone di isolamento mitocondriale ai mitocondri raccolti per diluirlo a un volume triplo. Centrifuga a 15.000 xg e a quattro gradi Celsius per 20 minuti.
Scartare il supernatante e tenere il pellet. Raccogliere il pellet finale che contiene i mitocondri purificati e conservarlo a 20 gradi Celsius. In primo luogo, preparare 250 millilitri del buffer di isolamento mitocondriale come delineato nel protocollo di testo.
Aggiungere circa 1,5 grammi dei normali tessuti ovarico di controllo a un piatto di vetro pulito. Aggiungere due millilitri di tampone di isolamento mitocondriale pre-refrigerato per lavare leggermente il sangue dalla superficie del tessuto. Ripetere questo lavaggio tre volte.
Utilizzando forbici oftalmiche pulite, tritare completamente il tessuto in pezzi che sono di circa 1 millimetro cubo e trasferire i tessuti tritati in un tubo pulito da 50 millilitri. Aggiungere otto millilitri di una soluzione contenente lo 0,05% di tripside e 20 millimolare EDTA e PBS ai tessuti di controllo tritati e digerire a temperatura ambiente per 30 minuti per aiutare a lisciviare le cellule e rilasciare i mitocondri. Centrifuga a 200 xg per cinque minuti.
Scartare il supernatante e tenere i tessuti e le cellule. Aggiungere 13,5 millilitri di tampone di isolamento mitocondriale contenente nagarse a una concentrazione di 0,2 milligrammi per millilitro e utilizzare un omogeneizzatore elettrico per omogeneizzare i tessuti tritati a quattro gradi Celsius per due minuti. Aggiungere altri tre millilitri di tampone di isolamento mitocondriale agli omogeneati tissutali e mescolare accuratamente mediante pipettazione.
Centrifugare il tessuto preparato omogeneizzato a 1,300 xg e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere il pellet e mantenere il supernatante. Centrifuga il supernatante a 10.000 xg e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Rimuovere il supernatante, che contiene i microsomi, e mantenere il pellet. Quindi, aggiungere 2 millilitri di tampone di isolamento mitocondriale e sospendere completamente il pellet mediante pipettazione leggera. Centrifuga questa sospensione a pellet a 7.000 xg e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Scartare il supernatante e conservare il pellet che contiene i mitocondri grezzi. Aggiungere 12 millilitri di mezzo gradiente di densità del 25% per sospendere di nuovo i mitocondri grezzi estratti. Creare un gradiente di densità discontinuo contenente i mitocondri grezzi come delineato nel protocollo di testo e centrifugarlo a 52.000 xg e a quattro gradi Celsius per 90 minuti.
Utilizzare una siringa lunga e smussata per raccogliere i mitocondri purificati nell'intervallo dall'interfaccia tra i mezzi gradienti 25 e 30% all'interfaccia tra i mezzi gradienti 34 e 38%.. Trasferire i mitocondri purificati in un tubo pulito. Aggiungere il tampone di isolamento mitocondriale ai mitocondri raccolti per diluirlo a un volume triplo.
Centrifugare a 15.000 xg e a quattro gradi Celsius per 20 minuti, e scartare il supernatante. Aggiungere 2 millilitri di tampone di isolamento mitocondriale per sospendere di nuovo il pellet e la centrifuga a 15.000 xg e a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Scartare il supernatante e conservare il pellet.
Raccogliere il pellet finale e conservarlo a 20 gradi Celsius. In questo studio, campioni mitocondriali di alta qualità sono preparati da cancro ovarico umano e tessuti di controllo per la proteomica quantitativa su larga scala. Ci sono alcune differenze nella preparazione dei mitocondri dai tessuti tumorali ovariani e controllare i tessuti ovarico, incluso l'uso di un diverso gradiente di densità discontinua.
Dopo la centrifugazione, i mitocondri purificati dai tessuti tumorali ovariani si trovano nell'interfaccia tra il 25% e il 30%, mentre quelli dei tessuti ovarico di controllo si trovano nell'intervallo dall'interfaccia tra il 25% e il 30% all'interfaccia tra il 34% e il 38%La qualità dei mitocondri preparati viene quindi valutata con centrifugazione della velocità differenziale e centrifugazione del gradiente di densità tramite microscopia elettronica. Le immagini al microscopio elettronico dimostrano che sia nei tumori ovarico che nei tessuti ovaiali di controllo, i principali organelli isolati sono i mitocondri, ad eccezione di una piccola quantità di perossisomi. Tuttavia, la morfologia dei mitocondri è vista cambiare più nei tumori ovai che nel controllo del tessuto ovarico.
La qualità dei mitocondri preparati viene valutata anche tramite macchia occidentale. Le immagini western blot dimostrano anche che il componente principale nei campioni mitocondriali preparati da tumori ovai e ovaie di controllo sono i mitocondri, ad eccezione di una piccola quantità di perossisomi, che è coerente con l'analisi della microscopia elettronica. È ragionevole che i perossisomi siano contenuti nei mitocondri preparati, perché i mitocondri interagiscono ampiamente con i perossisomi, che a loro volta riflettono la completezza funzionale dei mitocondri.
Questi risultati dimostrano l'alta qualità dei campioni mitocondriali preparati. Quando sto eseguendo questa procedura, è molto importante che si tritano completamente i tessuti prima dell'omogeneizzazione, e si aggiungo la tripina ai tessuti di controllo tritati. È anche importante creare e o preparare gradiente di densità discontinua per i campioni di cancro e i controlli.
Seguendo questa procedura, la proteomica quantitativa iTRAQ o TMT o la fosfoproteomica possono essere eseguite per chiarire il profilo del proteoma dei mitocondri del cancro ovarico e il profilo del fosfoproteoma può essere stabilito per chiarire i ruoli dei mitocondri nel cancro ovarico in grandi profondità. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per studiare sistematicamente il proteoma dei mitocondri e il fosfoproteoma nel cancro alle ovaie, costruire il sistema di rete di vie di segnalazione e scoprire i biomarcatori affidabili e gli obiettivi terapeutici.
