Preparare il mouse per l'intervento chirurgico. Radere i quadranti inferiori dell'addome usando un rasoio e disinfettare l'area con iodio. Posizionare il mouse su una superficie di lavoro pulita sulla schiena con la testa rivolta lontano dall'operatore.
Fai un'incisione longitudinale della pelle lunga circa mezzo centimetro nell'addome inferiore sinistro. Fare attenzione a non penetrare nella cavità peritoneale. Usa piccole forbici per estendere l'incisione di circa uno o due centimetri.
Fare un'incisione intramuscolare per ottenere l'accesso alla cavità peritoneale. Nella maggior parte dei casi, il cieco si trova sul lato sinistro dell'addome. Isolare il cieco.
Utilizzando forcep smussate e anatomiche, esporre delicatamente e accuratamente il cieco attraverso l'incisione. Il quarto passo è la legazione. La posizione della legatura sul cieco determina il livello di gravità della sepsi.
Legare circa il 75% del cieco induce una sepsi grave. Legare il 50% del cieco induce sepsi di medio livello. Mentre legare il 25% o meno del cieco si tradurrà in sepsi minore.
Ligate il cieco nella posizione designata. Assicurarsi di non ligare la valvola ileocecale. Il quinto passo è quello di forare il cieco.
Usando un ago, perforare il cieco con una singola puntura attraverso e attraverso la foratura a metà strada tra la legatura e la punta del cieco. Assicurati di non forare alcun vasi sanguigni. Per assicurarsi che ci fosse una puntura completa, estrudere una piccola goccia di feci da entrambi i fori dell'ago.
Sostituire con cura il cieco nella cavità addominale. Chiudere la muscolatura addominale applicando semplici suture da corsa e chiudere la pelle. Pulire la pelle con iodio.
Iniettare al topo una soluzione salina preri warmed per rianimare. Riposizionare il mouse nella gabbia con accesso illimitato a cibo e acqua. Dopo circa tre giorni dalla legatura cecale e dalla puntura o dalla procedura CLP, sottosenziamo il topo a un secondo colpo con un'infezione intranasale per stimolare la polmonite che spesso si verifica in sepsi.
Avvicinati al collo del mouse da dietro, senza intoppi e delicatamente. Il pollice e l'indice della mano sinistra formano una posizione a forma di U. Tieni il collo immediatamente dietro le orecchie in modo che la testa del mouse sia completamente contenuta.
Introdurre l'infezione intranasale. Utilizzando una pipetta da 100 microliter, infondere il ceppo di stafilococco aureo per via intranasale. Tenendo il mouse in posizione verticale, far cadere lentamente da due a tre microlitri della soluzione batterica in entrambe le narici del topo.
Sollevare il mouse su e giù con la testa su e la coda verso il basso per aiutare la soluzione batterica a entrare nella trachea. Sollevare rapidamente il mouse abbassarlo delicatamente e lentamente. Ripetere l'instillazione 15 volte o fino a quando non viene instillata tutta la soluzione batterica.
L'ultimo passaggio è completare la procedura. Appoggiare il mouse sulla biancheria da letto angolata con un angolo di circa 35 gradi per recuperare. Assicurarsi che il mouse sia sulla schiena con la testa sdraiata.
Guarda il mouse per assicurarti che sia completamente recuperato dall'anestesia e dalla procedura. Dopo aver appiattito la biancheria da letto, riposizionare il mouse nella gabbia con accesso illimitato a cibo e acqua. I topi hanno iniziato a morire circa 12 ore dopo l'induzione della peritonite.
La mortalità era molto più alta per i topi con CLP prima di una polmonite. Tre giorni dopo l'intervento chirurgico, i topi CLP avevano più mortalità con una somministrazione intranasale di stafilococco aureo. I livelli di citochine pro-infiammatorie del siero sono aumentati significativamente a 24 ore dopo l'instillazione batterica nei topi di sepsi rispetto ai topi che avevano CLP da soli o ai topi operati da Sham con un secondo colpo.
Tuttavia, i topi a doppio colpo hanno mostrato una significativa diminuzione dei livelli di citochina del fluido BAL rispetto alla chirurgia SA e Sham più topi SA. Quindi il CLP compromette la difesa dell'ospite e aumenta la suscettibilità alle infezioni. Questo modello a doppio colpo è uno strumento prezioso per comprendere i meccanismi molecolari per l'interazione ospite-patogeno, che possono aprire la strada allo sviluppo di nuovi farmaci efficaci e altre terapie per le infezioni da superbug.
