Utilizzando questo protocollo, le forme ubiquitinate di una data proteina possono essere efficacemente purificate dalle cellule di mammifero, facilitando gli studi sui ruoli dell'ubiquitinazione nella regolazione della funzione proteica. La purificazione delle proteine ubiquitinate nelle cellule di mammifero rispetto alla purificazione in vitro mantiene la modalità di legame ubiquitina delle proteine bersaglio in condizioni più radiologiche. Iniziare aggiungendo 1,5 millilitri di mezzo sierico ridotto in tre provette da centrifuga da 15 millilitri.
Aggiungere DNA plasmidico pronto per la trasfezione a ciascun tubo e aggiungere 0,2 microgrammi di plasmide proteico fluorescente verde per monitorare l'efficienza della trasfezione. Aggiungere 78 microlitri di reagente di trasfezione liposomica a 4,5 millilitri di mezzo sierico ridotto in un'altra provetta da centrifuga per diluire i liposomi. Mescolare accuratamente facendo scorrere il tubo e poi lasciarlo riposare per cinque minuti a temperatura ambiente.
Aggiungere 1,5 millilitri della soluzione liposomica diluita in ciascuna provetta contenente 1,5 millilitri della soluzione di DNA diluito. Mescolare accuratamente e reticolare i plasmidi con i liposomi per almeno 20 minuti a temperatura ambiente. Scartare il mezzo originale dalle piastre di Petri e aggiungere nove millilitri del mezzo sierico ridotto in ogni piatto.
Aggiungere tre millilitri della miscela di DNA liposomico e mescolare la soluzione agitando delicatamente la piastra avanti e indietro tre volte e poi a destra e sinistra tre volte per una distribuzione uniforme della miscela sulla piastra. Coltivare le cellule nell'incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Sostituire il mezzo dopo quattro-sei ore e continuare a coltivare le cellule per 24-36 ore.
Dopo 24-36 ore, trattare le cellule con MG132 ad una concentrazione finale di 10 micromolari per quattro-sei ore. Scartare il mezzo e lavare le celle due volte con PBS ghiacciato. Aggiungere un millilitro di PBS al piatto.
Rimuovere le cellule raschiandole con un raschietto pulito e trasferire la sospensione cellulare in provette da microcentrifuga. Centrifugare a 700 g per cinque minuti per raccogliere i pellet cellulari. Aggiungere 800 microlitri di tampone di lisi ghiacciato FLAG integrato con cocktail inibitore della proteasi alle cellule di ciascuna provetta.
Mescolare le celle usando un oscillatore a vortice o una pistola per pipette e quindi incubare la miscela su un rotatore a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Ultrasonicare la miscela sul ghiaccio con ogni impulso della durata di un secondo e sottoporre la miscela a cinque o 10 brevi impulsi. Incubare la miscela su un rotatore a 40 RPM per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi centrifugare i campioni ultrasonicati a 8.000 G per 20-30 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga. Aliquot 80 microlitri dell'estratto cellulare e miscelare con 20 microlitri di tampone di carico 5X SDS.
Far bollire i campioni a 98 gradi Celsius per cinque minuti. Raffreddare sul ghiaccio per due minuti e conservare a meno 20 gradi Celsius fino all'uso. Utilizzare questi campioni come gruppo di input per monitorare l'espressione proteica.
Quindi, aggiungere 30 microlitri di perle coniugate con anticorpi anti-FLAG M2 agli estratti cellulari rimanenti e incubare su un rotatore a quattro gradi Celsius per almeno quattro ore o durante la notte. Centrifugare a 1.500 g per due minuti a quattro gradi Celsius per raccogliere le perle. Aggiungere un millilitro di tampone di lisi FLAG ghiacciato alle perle e mescolare capovolgendo più volte il tubo.
Ripetere questo passaggio da quattro a sei volte, quindi aggiungere 40 microlitri di peptidi FLAG ad una concentrazione finale di 200 nanogrammi per microlitro alle perline. Incubare su un rotatore per due ore come mostrato in precedenza e quindi centrifugare alla stessa temperatura. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga e aggiungere 10 microlitri di tampone di carico 5X SDS.
Far bollire il composto a 98 gradi Celsius per cinque minuti e poi raffreddarlo sul ghiaccio per due minuti. Aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato ai pellet cellulari e mescolare uniformemente. Aliquot 100 microlitri della sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga come campione di ingresso e centrifugare a 700 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per raccogliere i pellet cellulari.
Aggiungere 80 microlitri di tampone di lisi FLAG al campione di ingresso e mescolare le celle usando un oscillatore a vortice come mostrato in precedenza. Lisare le cellule sul ghiaccio per un'ora e poi centrifugare di nuovo per 20-30 minuti. Dopo la centrfusione, trasferire 80 microlitri di surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga e aggiungere 20 microlitri di tampone di carico 5X SDS al surnatante.
Far bollire la miscela a 98 gradi Celsius per cinque-10 minuti e poi raffreddare sul ghiaccio per due minuti. Centrifugare i restanti 900 microlitri della sospensione cellulare a 700 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per raccogliere il pellet cellulare. Aggiungere un millilitro di tampone ubiquitina 1 ai pellet cellulari e mescolare pipettando su e giù più volte per distribuire uniformemente le cellule.
Sottoporre i lisati cellulari a 10-20 cicli di ultrasuoni su ghiaccio fino a quando la soluzione non è più viscosa, quindi centrifugare la soluzione. Trasferire il surnatante in una nuova provetta di microcentrifuga e aggiungere 30 microlitri di resina carica di nichel al surnatante. Incubare su un rotatore a 15 RPM per quattro ore o durante la notte a temperatura ambiente e quindi centrifugare per due minuti.
Dopo la centrifusione, raccogliere le perle e aggiungere un millilitro di ubiquitina tampone 1 ad esso. Incubare con rotazione in uno shaker per 10 minuti a temperatura ambiente e quindi centrifugare nuovamente a 1.500 G per due minuti, come mostrato in precedenza. Aggiungere un millilitro di ubiquitina tampone 2 alle perle ed eseguire l'incubazione seguita da centrifugazione, come mostrato in precedenza, per raccogliere le perle.
Ripetere questo passaggio una volta. Quindi, aggiungere un millilitro di PBS alle perle e seguire la stessa procedura per l'incubazione e la centrifugazione per raccogliere le perle. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
Eluire le proteine legate incubando le perle con 40 microlitri di imidazolo ad una concentrazione finale di 0,5 molari per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, centrifugare nuovamente a 1.500 G per due minuti. Trasferire il surnatante in una provetta di microcentrifuga pulita e aggiungere 10 microlitri di tampone di carico 5X SDS.
Far bollire la soluzione a 98 gradi Celsius per cinque minuti e quindi raffreddarla sul ghiaccio per due minuti. Risolvere i campioni mediante SDS-PAGE e quindi trasferirli su una membrana di nitrocellulosa mediante western blotting per rilevare le proteine bersaglio utilizzando gli anticorpi corrispondenti. Avviare il sistema di imaging a chemiluminescenza per rilevare i segnali dal western blotting.
Posizionare la membrana di nitrocellulosa nella camera oscura rivolta verso l'alto. Codificare la soluzione di substrato in modo uniforme sulla membrana utilizzando una pistola per pipette. Infine, selezionare la procedura di esposizione automatica per catturare i segnali chemiluminescenti e regolare manualmente il tempo di esposizione fino a quando non viene acquisito un segnale ideale.
La proteina p53 totale, inclusa la p53 ubiquitinata, è stata immunoprecipitata con sfere FLAG M2 da cellule H1299 in condizioni di non denaturazione. L'eluato è stato sottoposto a western blotting con anti p53 e anti emoagglutinina o con anticorpi anti p53 e monoclonali. Qui, gli estratti o gli input di cellule grezze sono stati sottoposti a western blotting con anticorpi monoclonali anti p53 e anti MDM2.
Il segnale della proteina p53 ubiquitinata che appare come una banda spalmata da basso ad alto peso molecolare è stato marcatamente aumentato quando MDM2 è stato espresso ectopicamente in queste cellule. Questo risultato suggerisce che la proteina p53 ubiquitinata è stata efficacemente purificata dalle cellule. Successivamente, le cellule sono state lisate in condizioni di denaturazione.
Le proteine ubiquitinate cellulari totali sono state abbattute con resina carica di nichel e sono state quindi sottoposte a western blotting con anticorpi monoclonali anti p53 e anti emoagglutinina. La proteina p53 ubiquitinata è stata rilevata utilizzando un anticorpo anti p53 e un anticorpo anti emoagglutinina. Qui al grezzo gli estratti o gli input cellulari grezzi sono stati sottoposti a western blotting con anticorpi monoclonali anti p53 e anti MDM2.
I risultati hanno mostrato che il livello totale di proteina ubiquitinata era invariato, ma il livello di proteina p53 ubiquitinata era drammaticamente aumentato dopo che MDM2 era sovraespresso in queste cellule. Ciò indica che le proteine ubiquitina totali contenenti p53 ubiquitinata sono state effettivamente estratte dai lisati cellulari in condizioni di denaturazione. Quando si tenta questa procedura, ricordarsi di trattare le cellule con MG132 prima della raccolta cellulare e ultrasonicare correttamente le cellule sul ghiaccio per la purificazione delle proteine ubiquitinate.
