Questo protocollo può essere utilizzato per eseguire la consegna migliorata della convezione in piccoli roditori utilizzando un sistema di catetere a gradini per la perfusione uniforme regolabile delle regioni cerebrali bersaglio. Il vantaggio della consegna potenziata dalla convezione è che consente la consegna di sostanze nella regione di interesse bypassando la barriera ematico-encefalica con pochi danni ai tessuti o reflusso. Questa tecnica è utile principalmente per la consegna di sostanze terapeutiche come gli anticorpi nel cervello.
E può quindi essere usato per colpire molte condizioni neurologiche. A dimostrare la procedura sarà Michal Beffinger, un post-doc del mio laboratorio. Inizia tagliando un pezzo di tubi capillari di silice fusi con un diametro interno di 0,1 millimetri e uno spessore della parete di 0,325 millimetri a una lunghezza di 30 millimetri.
Dopo aver esaminato i tubi per le crepe, utilizzare una microforgia per lucidare termicamente le estremità per garantire che le aperture dei tubi abbiano una superficie liscia. Quindi, montare un ago calibro 27 su una siringa da 10 micro litri e posizionare la siringa in un robot stereotattico. Utilizzare il robot per spostare la siringa su una superficie dura e toccare la superficie con la punta dell'ago.
Dopo aver annotato questa posizione elevare l'ago per consentire il posizionamento del capillare di silice fusa all'interno dell'ago in modo tale che 20 millimetri del capillare sporge dall'ago. Utilizzare una pipetta per stendere uniformemente due microlitri di adesivo cianoacrilato ad alta viscosità sul capillare partendo dall'ago metallico e finendo dieci millimetri sopra l'estremità inferiore del capillare. Utilizzare il robot stereotattico per abbassare l'ago metallico fino a quando la punta dell'ago non è di un millimetro sulla superficie di riferimento per fissare il capillare di silice fusa nell'ago metallico formando un passo millimetro dalla punta dell'ago metallico.
Rimuovere la colla in eccesso che si forma all'estremità dell'ago metallico per evitare di piantare il gradino del catetere. Controllare la punta al microscopio per confermare che tutta la colla in eccesso è stata rimossa. Quindi attendere 15 minuti che la colla si indurisca e rimuovere la siringa con il catetere dal robot.
Per il test del catetere a gradini tagliare il gel solidificato allo 0,6% di agarosio in blocchi da 20 per 20 millimetri e riempire manualmente la siringa del catetere a gradini con 10 microlitri di soluzione blu tripano filtrata allo 0,4%. Utilizzando il robot stereotattico, erogare un microlitro di colorante a 0,2 micro litri al minuto per valutare la sigillatura della fase del catetere durante la procedura di fissazione. La soluzione blu trypan dovrebbe essere visibile esclusivamente sulla punta del catetere.
Pulire il colorante con un tessuto di carta e posizionare un blocco di agarosio nel robot stereotattico. Calibrare il robot ha detto che la punta del catetere è referenziata sulla superficie del blocco di agarosio. Impostare una sequenza proporzionale di volumi di iniezione in base al piano sperimentale specifico.
Per iniettare la soluzione nel putamen caudato murino, impostare l'iniezione su un millimetro frontale e uno e mezzo a due millimetri laterale dalla posizione del bregma a una profondità di 3,5 millimetri. Quando l'ago è in posizione, avviare la procedura di consegna migliorata convezione e iniettare cinque microlitri di soluzione blu trypan nel blocco di agarosio. Valutare la forma della nuvola blu del trypan nell'agarosio e la potenziale perdita lungo il tratto del catetere.
Non dovrebbe essere visibile alcun riflusso importante sulla punta dell'ago metallico. Dopo l'iniezione lasciare il catetere in posizione per due minuti prima di ritrarre l'ago a un millimetro al minuto per garantire una corretta dispersione del fluido nel cervello e la sigillatura del tratto di iniezione durante la rimozione. Posizionare un nuovo blocco di agarosio nel robot e iniziare una seconda iniezione di un microlitro a 0,2 micro litri al minuto per valutare l'intasamento del catetere all'interno dell'agarosio.
Il tripano blu dovrebbe formare di nuovo una nuvola dalla punta del catetere immediatamente dopo l'inizio dell'iniezione. Quindi valutare se il volume rimasto nella siringa corrisponde a 3 microlitri in quanto eventuali variazioni potrebbero indicare una perdita di fluido attraverso il montaggio del catetere o lo stantuffo della siringa. Per l'iniezione di anticorpi nello striato murino confermare una mancanza di risposta al pizzico di pelle in un topo anestetizzato e radere la testa con un trimmer per capelli.
Disinfettare la pelle con tamponi di cotone imbevuti di soluzione di iodio. Usa un bisturi per fare un'incisione cutanea di 10 millimetri lungo la finitura della linea mediana cranica a livello degli occhi. Fissare il mouse nel telaio stereotattico utilizzando il morsetto del naso e le barre dell'orecchio, facendo attenzione che la superficie del cranio sia orizzontale e strettamente fissata.
Posizionare la siringa nel robot stereotattico e sincronizzare la punta del trapano con la punta del catetere su un punto di riferimento. Utilizzare le forcep per ritrarre la pelle e localizzare il bregma sulla superficie del cranio. Fare riferimento al bregma nel software utilizzando la punta della punta del trapano e spostare il trapano su un millimetro frontale e due millimetri lateralmente dalla posizione del bregma.
Praticare un foro di bava facendo attenzione a non danneggiare la dura mater e spostare la siringa sul foro di bava. Erogare 0,5 a un microlitro dalla siringa per assicurarsi che non vengano lasciate bolle d'aria nel catetere. Inizia la consegna migliorata della convezione come dimostrato, osservando la superficie del cranio per eventuali tracce di riflusso di fluido dal punto di iniezione.
Al termine dell'erogazione e della rimozione del catetere avviare la pompa di iniezione a 0,2 micro litri al minuto per verificare la presenza di intasamento del catetere durante l'iniezione. Se non si è verificato alcun intasamento, si deve immediatamente osservare una goccia di miscela di iniezione proveniente dalla punta del catetere. In questa immagine di una nuvola di tripano di formatura blu dopo l'iniezione di un microlitro di colorante a 0,5 micro litri al minuto utilizzando un catetere potenziato convezione come dimostrato, nessun reflusso lungo il tratto dell'ago era visibile all'inizio del passo del catetere.
E la nube dispersa formava una forma sferica desiderata. In questa immagine utilizzando un ago finale smussato, tuttavia, si potrebbe osservare un significativo reflusso. In particolare, l'erogazione migliorata della convezione consente la perfusione di grandi volumi nel cervello murino in modo uniforme e meno dannoso per i tessuti rispetto all'iniezione convenzionale.
In entrambi i tipi di consegna c'è un tipico profilo di distribuzione di anticorpi e particelle di dextran sul corpo calloso. Tuttavia, il profilo di dispersione dell'anticorpo iniettato è più diffuso di quanto si osservi per il dextran ad alto peso molecolare dopo una consegna migliorata della convezione, esemplificando le differenze nella distribuzione tra diversi infusi. Poiché il catetere può potenzialmente intasarsi durante l'infusione cerebrale, è importante controllarlo immediatamente dopo erogando lentamente un piccolo volume di infuso.
Questa procedura può servire come un modo per fornire composti farmacologicamente attivi al cervello e dovrebbe essere seguita da uno stretto monitoraggio dei sintomi della malattia e degli effetti collaterali attesi. Questa tecnica consente l'infusione di una regione cerebrale precisa con terapie tra cui anticorpi, aprendo nuove possibilità per lo sviluppo di terapie mirate del sistema nervoso centrale.
