Riconosciamo il sostegno della tenuta del Dr Clem Jones AO, del National Health and Medical Research Council of Australia [GNT1145580, GNT1176326], della Metal Foundation e del governo statale del Queensland (DSITI, Dipartimento di Scienza, Information Technology e Innovazione).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico animale dell'Università del Queensland.
1. Preparazione di microbolle interne
<ol><li>Pesare un rapporto molare 9:1 di 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina e 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[ammino (polietilenglicole)-2000] (sale di ammonio). Sono necessari 0,5 mg di miscela lipidica per 1 mL di soluzione di microbolle. In alternativa, i lipidi possono essere acquistati già nel cloroformio, se si utilizzano lipidi pre-disciolti si procede al passaggio 1.3.</li>
	<li>Sciogliere il lipide in un piccolo volume di cloroformio in un becher di vetro.</li>
	<li>Evaporare il cloroformio con un evaporatore o un flusso di azoto.</li>
	<li>Reidratare il film lipidico essiccato con 10 ml di PBS + 10% di glicerolo + 10% di soluzione di glicole propilenico che è stata filtrata attraverso un filtro da 0,22 μm.</li>
	<li>Posizionare la soluzione lipidica reidratata in un sonicatore a bagnomaria impostato a 55 °C (al di sopra della temperatura di fusione dei lipidi) e sonicare fino a completa dissoluzione.</li>
	<li>Soluzione lipidica aliquota in flaconcini HPLC autoclavati da 1,5 mL e avvitare i tappi dei setti.</li>
	<li>Aspirare tutta l'aria nel flaconcino con una siringa da 5 mL dotata di un ago da 27 G e creare un vuoto nel flaconcino.</li>
	<li>Aggiungere l'octofluoropropano al flaconcino con la siringa inclusa, prelevando il gas dal contenitore. Riempire il flaconcino con 1-2 mL di ottafluoropropano leggendo il volume nella siringa.</li>
	<li>Sigillare ogni flaconcino con pellicola di paraffina e conservare in frigorifero.</li>
	<li>Il giorno dell'esperimento, portare il flaconcino a temperatura ambiente, aggiungere 0,5 mL di soluzione di NaCl allo 0,9% al flaconcino, quindi posizionare il flaconcino in un amalgamatore e agitare per 45 s (tempo preimpostato) per produrre le microbolle.</li>
</ol>2. Controllo di qualità delle microbolle utilizzando un contatore coulter
<ol><li>Estrarre la soluzione di microbolle dall'amalgamatore e sfiatare il gas dal flaconcino perforando i setti con un ago da 19 G.</li>
	<li>Diluire la soluzione di microbolle eseguendo diluizioni seriali 1:5.000 in due fasi aggiungendo 100 μL di soluzione di microbolle in 5 mL di soluzione a flusso filtrato utilizzando una siringa da 1 ml con ago da 19 G, quindi prendendo 100 μL di soluzione di microbolle diluita 1:50 e pipettando in 10 mL di soluzione a flusso filtrato in una cuvetta utilizzando una pipetta.</li>
	<li>Controllare che il serbatoio dell'elettrolita abbia una soluzione di flusso sufficiente e che il serbatoio dei rifiuti sia vuoto.</li>
	<li>Posizionare la cuvetta nella contropiattaforma coulter e bloccarla in posizione. Utilizzare un'apertura di 30 μm per l'acquisizione del campione.</li>
	<li>Nel software, caricare il metodo operativo standard (SOM), quindi selezionare Modifica SOM | concentrazione. Immettere la diluizione 5000x.</li>
	<li>Nel software, scegli un nome di file adatto. Ad esempio, microbubble_1_date.</li>
	<li>Caricare e fissare la cuvetta nella piattaforma.</li>
	<li>Nel software selezionare Esegui| Visualizzare in anteprima e verificare che la concentrazione del campione sia inferiore al 10%. Se questo numero è superiore al 10%, eseguire una nuova diluizione delle microbolle con un fattore di diluizione più elevato.</li>
	<li>Selezionare 'Start' per iniziare un'acquisizione del campione per ottenere la lettura iniziale.</li>
	<li>Risciacquare l'apertura del contatore Coulter con una soluzione di flusso filtrata dopo ogni misurazione. Ripetere i passaggi 2.2-2.9 per ottenere 3 repliche.</li>
	<li>Posizionare una cuvetta con soluzione di microbolle diluita in un bagno d'acqua sonicatore e sonicare per 30 s.</li>
	<li>Misurare la soluzione con microbolle sonicate ed etichettarla come vuota.</li>
	<li>Nel software, sottrarre la lettura finale dalla lettura iniziale. Questo sottrae tutte le particelle che non sono microbolle e non contengono gas.</li>
	<li>Selezionare Visualizza risultati nel software per visualizzare la concentrazione di microbolle, la distribuzione dimensionale, la dimensione media e la concentrazione di volume.</li>
</ol>3. Etichettatura degli anticorpi fluorescenti
<ol><li>Ottenere una soluzione da 1 mg/mL di IgG di topo in PBS senza additivi.</li>
	<li>Etichettare 1 mg di IgG del mouse con AlexaFluor 647 in tampone di bicarbonato di sodio 0,1 M seguendo le istruzioni del produttore presenti nel kit. Questa quantità di IgG marcate fluorescentemente è sufficiente per eseguire questa procedura su 5-7 topi adulti in cui viene somministrata una dose di anticorpi di 5 mg/kg.</li>
	<li>Aggiungere il colorante alla soluzione di IgG in tampone di bicarbonato di sodio 0,1 M e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Purificare l'anticorpo marcato fluorescente pipettando la soluzione anticorpale in una colonna di spin e centrifugando a 1.000 x g per 5 minuti. La tintura libera rimarrà nel letto della colonna.</li>
	<li>Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la concentrazione proteica. Misurare l'assorbanza della soluzione coniugata a 280 nm e 650 nm (A280 e A650). Calcola la concentrazione di proteine nel campione usando l'equazione: Concentrazione proteica (M) = [A280 - (A650 x 0,03)] x fattore di diluizione / 203.000.</li>
	<li>Utilizzare uno spettrofotometro per calcolare il grado di etichettatura utilizzando l'equazione: colorante per mole proteina = A650 x fattore di diluizione / 239 000 x concentrazione proteica (M). NOTA: un grado accettabile di etichettatura è di 3-7 moli colorante per proteina talpa e il grado di etichettatura tipicamente ottenuto è di circa 6.</li>
</ol>4. Configurazione ad ultrasuoni
<ol><li>Utilizzando il sistema ad ultrasuoni focalizzato, aggiungere il distanziatore da 5 mm al bolo d'acqua per posizionare il fuoco ad ultrasuoni 9 mm sotto il fondo del bolo d'acqua.</li>
	<li>Riempire il bolo d'acqua con circa 300 ml di acqua deionizzata che è stata degassata con un degasatore in linea per 20 minuti (il contenuto di ossigeno deve essere inferiore a 3 ppm). Posizionare l'array anulare nel bolo d'acqua riempito e utilizzare uno specchio dentale per verificare che non ci siano bolle d'aria sulla superficie. Se presente sulla superficie, rimuovere l'array anulare e sostituirlo nel bolo d'acqua.</li>
	<li>Avviare il software applicativo. Nel menu forma d'onda, selezionate Imposta ciclo di lavoro della forma d'onda. Le impostazioni sono PRF (Hz) 10, duty cycle 10%, messa a fuoco 80 mm, frequenza centrale 1 MHz, ampiezza (pressione negativa di picco MPa) 0,65 MPa, indice meccanico = 0,65. Premere Imposta per definire la forma d'onda e memorizzarla in memoria. NOTA: il sistema a ultrasuoni focalizzato è pre-calibrato dal produttore da misurazioni effettuate da un idrofono calibrato.</li>
	<li>Nel software del sistema a ultrasuoni focalizzato, definire un piano di trattamento. Ciò richiede la definizione di una regione di trattamento composta da più siti di trattamento individuali e la definizione di azioni da intraprendere in ciascuno di tali siti di trattamento. In questo caso, la zona di trattamento è un emisfero del cervello del topo.</li>
	<li>Nella finestra del controller di movimento, accedete alla scheda Scansione e immettete il valore di avvio, arresto e incremento per il movimento nella quota x e il valore di avvio, arresto e incremento per il movimento nella direzione y. Immettere i valori per X: start -4, stop 3.50 e Y: -3.00, stop 3, Increment 1.5, # loops: 1.</li>
	<li>Definire le azioni per i siti di trattamento. Nella finestra del controller di movimento, selezionare il pulsante Evento . Nella finestra di modifica degli script, selezionare un elenco di azioni che verranno eseguite nell'ordine selezionato in ciascun sito di trattamento. Impostare Tipo di movimento sulla griglia raster nella parte superiore della finestra dello script. Nella scheda eventi selezionare Aggiungi azioni per spostarle nel pannello script e aggiungere Sposta in modo sincrono, Avvia trigger arb, attendi, Interrompi trigger arb. Fare clic sull'azione di attesa e selezionare un tempo di attesa di 6.000 ms. NOTA: Queste impostazioni renderanno il trattamento una griglia 6 x 5 di punti di trattamento distanziati di 1,5 mm l'uno dall'altro, con ogni punto che ha una durata del trattamento di 6 s. La durata totale per sonicare un cervello di topo è di circa 3 minuti. Questa griglia di trattamento è adatta per topi adulti C57/Bl6 di peso di circa 30 g. La dimensione della griglia dei punti di trattamento può essere regolata verso l'alto o verso il basso a seconda delle dimensioni del mouse.</li>
</ol>5. Preparazione degli animali
<ol><li>Pesare il mouse con una bilancia accurata a 0,1 g.</li>
	<li>Anestetizzare il topo con 90 mg/kg di ketamina e 6 mg/kg di xilazina per via intraperitoneale. Test per l'assenza di riflessi con un pizzico della punta. In alternativa, i topi possono essere anestetizzati con isoflurano utilizzando un appropriato apparato anestetico inalatorio con una maschera facciale appropriata. Se si utilizza isoflurano, il mouse deve essere posizionato su un cuscinetto di calore durante l'ecografia per prevenire l'ipotermia.</li>
	<li>Utilizzare un rasoio elettrico per radere i capelli dalla testa dell'animale, quindi applicare la crema per la depilazione con un batuffolo di cotone, lasciare in posa per 2-3 minuti o fino a quando i capelli non vengono puliti con un pezzo di garza umida. Fai attenzione che la crema per la depilazione non penetri negli occhi del topo.</li>
	<li>Segna il centro della testa del mouse con un pennarello permanente. Il trasduttore ha un foro al centro e la messa a fuoco e il punto focale del trasduttore possono essere allineati visivamente.</li>
	<li>Riempire una piccola barca di pesatura che in precedenza ha avuto il fondo tagliato e sostituito con un involucro di plastica incollato sul fondo della barca di pesatura con gel ad ultrasuoni. Questo funge da distanziatore da 8 mm e fornisce un buon accoppiamento alla testa del mouse e consente l'ispezione visiva della messa a fuoco del trasduttore allineato con la testa del mouse.</li>
</ol>6. Preparazione di microbolle
<ol><li>Riscaldare un flaconcino di microbolle a temperatura ambiente. Per attivare, aggiungere 0,5 mL di soluzione di NaCl allo 0,9% al flaconcino e mettere in un amalgamatore per agitare per 45 s per produrre le microbolle.</li>
	<li>Sfogare il flaconcino perforando i setti con un ago da 27 G.</li>
</ol>7. Trattamento ad ultrasuoni
<ol><li>Invertire il flaconcino delle microbolle e prelevare delicatamente 1 μL/g di peso corporeo della soluzione. A questo aggiungere la soluzione di anticorpi marcati fluorescentemente e mescolare delicatamente nella siringa. Il volume massimo iniettato è di 150 μL. NOTA: le microbolle preparate internamente sono circa 60 volte meno concentrate rispetto a quelle clinicamente utilizzate (ad esempio, le microbolle Definity). Regolare il volume o la concentrazione in modo tale che il numero di microbolle iniettate sia simile a quelli clinicamente utilizzati (es. Definizione 1,2 x 108 microbolle/kg di peso corporeo).</li>
	<li>Iniettare retroorbitalmente la microbolla e la soluzione anticorpale, avendo cura di iniettare delicatamente e lentamente. Quindi, applicare un unguento oftalmico agli occhi del topo.</li>
	<li>Posizionare il mouse nel supporto della testa (vedere Tabella dei materiali) e fissare il naso del mouse. Quindi posizionare la piccola barca di pesatura piena di gel ad ultrasuoni sulla parte superiore della testa.</li>
	<li>Abbassare il bolo d'acqua fino a quando non si trova sopra il gel ad ultrasuoni nella barca di pesatura.</li>
	<li>Utilizzare il joystick per spostare la messa a fuoco del trasduttore al centro della testa. Selezionate Reimposta origine (Reset Origin ) nella scheda Movimento (Motion).</li>
	<li>Selezionare la scansione completa. I passaggi 7.3-7.6 richiederanno 2 minuti.</li>
	<li>Per coerenza, impostare un timer per garantire un ritardo di 2 minuti tra l'iniezione di microbolle e la selezione della scansione completa.</li>
	<li>Al termine del trattamento, applicare un unguento oftalmico agli occhi e posizionare il topo in una camera di recupero riscaldata. Se si osserva ipotermia durante la procedura, un cuscinetto riscaldante può essere posizionato sotto il mouse per fornire calore supplementare durante la procedura.</li>
</ol>8. Raccolta e lavorazione dei tessuti
<ol><li>Nel momento di interesse dopo la somministrazione dell'ecografia (almeno 1 ora per rilevare alti livelli di anticorpi nel cervello) anestetizzare profondamente il topo con un sovradosaggio di soluzione di Pentobarbitone (100 mg/kg) e perfondere transcardialmente il topo con 30 ml di PBS. È necessaria una buona perfusione per rilevare specificamente gli anticorpi marcati con fluorescenza che sono stati consegnati al cervello.</li>
	<li>Raccogliere il cervello e fissare per immersione in PFA al 4% per 24 ore a 4 °C, quindi lavare con PBS.</li>
	<li>Immagina il cervello in uno scanner a infrarossi posizionando il cervello sul vassoio e acquisendo un'immagine nel canale a 700 nm. NOTA: Dopo la fissazione, il cervello viene rimosso dal PFA, lavato in PBS e sezionato. In alternativa, può essere posto in soluzione crioprotettiva di glicole etilenico per 24 ore a 4 °C o fino a quando non è immerso, quindi spostato in un nuovo flaconcino contenente crioprotettore e posto a -20 °C per la conservazione a lungo termine.</li>
	<li>Sezionare il freddo cerebrale in PBS usando un vibratoma. Incollare il cervello alla piattaforma e tagliare sezioni di 30-40 μm e raccogliere in PBS. NOTA: L'autofluorescenza lisosomiale (prevalente in sezioni di animali di età superiore a circa 12 mesi) deve essere sbiancata mediante illuminazione notturna delle sezioni in una scatola a camera luminosa, a temperatura ambiente e in PBS contenente azide (0,02%) per bloccare la crescita batterica.</li>
</ol>9. Colorazione dei tessuti e acquisizione delle immagini
<ol><li>Trasferire le sezioni alla soluzione bloccante (5% BSA in 0,2% Triton/PBS) per 2 ore a temperatura ambiente, quindi lavare le sezioni 3x sostituendo la soluzione con 0,2% Triton/PBS.</li>
	<li>Incubare sezioni a 4 °C durante la notte con gli anticorpi primari contro Iba1 (diluizione 1:1.000) e CD68 (diluizione 1:500), in Triton/PBS allo 0,2%, seguiti da 3x lavaggi con 0,2% Triton/PBS.</li>
	<li>Incubare sezioni per 2 ore a temperatura ambiente con anticorpi secondari fluorescenti (diluizione 1:500), seguite da 3x lavaggi con solo Triton/PBS allo 0,2%. NOTA: I nuclei possono anche essere colorati utilizzando la soluzione DAPI (0,5 μg/mL).</li>
	<li>Trasferire le sezioni su una slitta e coprire il coperchio con un supporto di montaggio rigido. Concedere tempo sufficiente affinché il supporto di montaggio si solidifichi prima della visualizzazione e dell'acquisizione dell'immagine (durante la notte).</li>
	<li>Con un microscopio confocale ottenere immagini z-stack (almeno 10 μm di profondità e 0,3 μm di dimensione del passo, 10 immagini per animale) dell'area cerebrale mirata agli ultrasuoni utilizzando un microscopio confocale e un obiettivo di almeno 40x di ingrandimento. NOTA: Fare attenzione ad acquisire immagini all'interno della gamma dinamica del segnale, evitando sotto/sovraesposizione. Salvare i file di immagine nel formato software corrispondente utilizzato dal microscopio.</li>
</ol>10. Analisi delle immagini
<ol><li>Convertire i file di microscopia z-stack utilizzando l'importatore di file del software di analisi delle immagini.</li>
	<li>Aprire i file convertiti nel software e regolare l'intensità del canale Iba1 per osservare le cellule microgliali.</li>
	<li>Ritaglia una singola cella microgliale disegnando una casella intorno ad essa, seleziona "ritaglia" e salva il nuovo file.</li>
	<li>Costruisci il rendering della superficie 3D del segnale IBA1 tramite:<ol>
<li>Aprire il file Imaris a cella singola generato nel passaggio precedente.</li>
		<li>Aggiungere un'area al file.</li>
		<li>Selezionare il canale corrispondente alla colorazione Iba1.</li>
		<li>Applicare una soglia che dovrebbe sovrapporsi alla colorazione Iba1</li>
		<li>Selezionare solo la struttura di interesse che sta formando la cellula microgliale di interesse</li>
	</ol>
</li>
	<li>Finalizzare il processo<ol>
<li>Ottenere e registrare il volume della colorazione Iba1</li>
		<li>Costruisci il rendering della superficie 3D della colorazione CD68</li>
		<li>All'interno del sottofile di superficie IBA1, mascherare il canale CD68 e rimuovere i voxel all'esterno della colorazione IBA1</li>
		<li>Aggiungere una nuova superficie al file</li>
		<li>Selezionare il canale corrispondente alla colorazione CD68</li>
		<li>Applicare una soglia che dovrebbe sovrapporsi alla colorazione CD68 e che corrisponda il più possibile ai volumi di colorazione</li>
		<li>Finalizzare il processo, poiché solo le strutture CD68 intra-microgliali saranno presenti in questo file e, quindi, non richiedono un altro passaggio di filtraggio della soglia</li>
		<li>Ottenere e registrare il numero e il volume medio delle strutture positive CD68</li>
		<li>Calcolare il volume relativo delle strutture CD68 per le corrispondenti strutture IBA1 come misura dell'attivazione microgliale in uno stato fagocitico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Choi, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+and+transient+blood-brain+barrier+opening+in+the+hippocampus+of+Alzheimer's+double+transgenic+mice+using+focused+ultrasound.">Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer's double transgenic mice using focused ultrasound.</a> Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).</li><li>Lipsman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+opening+in+Alzheimer's+disease+using+MR-guided+focused+ultrasound.">Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound.</a> Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).</li><li>Pandit, R., Chen, L., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier:+physiology+and+strategies+for+drug+delivery.">The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. (19), 30238 (2019).</li><li>Golde, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+questions+for+Alzheimer's+disease+immunotherapy.">Open questions for Alzheimer's disease immunotherapy.</a> Alzheimers Research &amp; Therapy. 6 (1), 3 (2014).</li><li>Nisbet, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effects+of+scanning+ultrasound+and+a+tau-specific+single+chain+antibody+in+a+tau+transgenic+mouse+model.">Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model.</a> Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).</li><li>Janowicz, P. W., Leinenga, G., G&#246;tz, J., Nisbet, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-mediated+blood-brain+barrier+opening+enhances+delivery+of+therapeutically+relevant+formats+of+a+tau-specific+antibody.">Ultrasound-mediated blood-brain barrier opening enhances delivery of therapeutically relevant formats of a tau-specific antibody.</a> Scientific Reports. 9 (1), 9255 (2019).</li><li>Leinenga, G., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+ultrasound+removes+amyloid-beta+and+restores+memory+in+an+Alzheimer's+disease+mouse+model.">Scanning ultrasound removes amyloid-beta and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Science Translational Medicine. 7 (278), 233 (2015).</li><li>Burgess, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+neural+stem+cells+to+the+brain+using+MRI-guided+focused+ultrasound+to+disrupt+the+blood-brain+barrier.">Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier.</a> PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound-enhanced+intranasal+brain+delivery+of+brain-derived+neurotrophic+factor.">Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor.</a> Scientific Reports. 6, 28599 (2016).</li><li>Leinenga, G., Langton, C., Nisbet, R., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+treatment+of+neurological+diseases+-+current+and+emerging+applications.">Ultrasound treatment of neurological diseases - current and emerging applications.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (3), 161-174 (2016).</li><li>G&#246;tz, J., Halliday, G., Nisbet, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Pathogenesis+of+the+Tauopathies.">Molecular Pathogenesis of the Tauopathies.</a> Annual Reviews of Pathology. 14, 239-261 (2019).</li><li>Pandit, R., Leinenga, G., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+ultrasound+treatment+of+tau+transgenic+mice+clears+neuronal+tau+by+autophagy+and+improves+behavioral+functions.">Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions.</a> Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).</li><li>Karakatsani, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+Focused+Ultrasound-Induced+Blood-Brain+Barrier+Opening+Reduces+Phosphorylated+Tau+from+The+rTg4510+Mouse+Model.">Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model.</a> Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).</li><li>Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+Diffusion+of+Macromolecule+Delivery+to+the+Brain+via+Focused+Ultrasound+using+Magnetic+Resonance+and+Multispectral+Fluorescence+Imaging.">Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Gli anticorpi marcati con fluorescenza possono essere consegnati al cervello utilizzando ultrasuoni focalizzati insieme a microbolle applicate in modalità di scansione. La somministrazione di anticorpi, la morfologia microgliale e l'allargamento lisosomiale possono essere rilevati al microscopio a fluorescenza dopo l'ecografia a scansione. Le microglia possono assorbire nei loro lisosomi anticorpi e antigeni a cui gli anticorpi si sono legati in un processo mediato dal recettore Fc4.
<p class...

L'ecografia terapeutica è una tecnologia emergente volta a trattare le malattie del cervello in modo non invasivo, in parte facilitando l'accesso di agenti terapeutici al cervello1,2,3. Poiché solo una piccola frazione degli anticorpi terapeutici che prendono di mira le malattie cerebrali viene assorbita e trattenuta nel cervello4, gli ultrasuoni terapeutici offrono la possibilità di aumentarne l'assorbimento e l'impegno target5,6.
Nel nostro laboratorio, stiamo sviluppando approcci terapeutici per le malattie neurodegenerative in cui un anticorpo in vari formati viene consegnato attraverso la barriera emato-encefalica (BBB) utilizzando microbolle. Per raggiungere questo obiettivo, gli ultrasuoni vengono applicati attraverso il cranio nel cervello in più punti utilizzando una modalità di scansione a cui ci riferiamo come ultrasuoni di scansione (SUS)7. L'interazione meccanica tra l'energia ultrasonica, le microbolle iniettate per via endovenosa e la vascolarizzazione cerebrale separa transitoriamente le giunzioni strette della BBB in un dato volume di sonicazione, consentendo agli anticorpi e ad altri carichi, compresi gli agenti terapeutici, di attraversare efficacemente questa barriera7,8,9 . Inoltre, gli ultrasuoni hanno dimostrato di facilitare l'assorbimento di anticorpi dal cervello interstiziale nelle cellule cerebrali, come i neuroni, dove l'anticorpo si distribuisce in tutto il corpo cellulare e persino nei processi neuritici5,10.
La malattia di Alzheimer è caratterizzata da una patologia amiloide-β e tau11 e una serie di modelli animali è disponibile per sezionare meccanismi patogenetici e convalidare strategie terapeutiche. Un approccio SUS, con il quale gli ultrasuoni vengono applicati in un modello sequenziale su tutto il cervello, se ripetuti in diverse sessioni di trattamento, possono ridurre la patologia della placca amiloide nel cervello dei topi mutanti della proteina precursore dell'amiloide-β-depositante l'amiloide (APP) e attivare microglia che assorbono l'amiloide, portando a un miglioramento della funzione cognitiva7. L'apertura BBB con ultrasuoni e microbolle riduce anche la patologia tau nei topi transgenici tau pR5, K3 e rTg4510 tau5,12,13. È importante sottolineare che, mentre la microglia rimuove i depositi proteici extracellulari, uno dei meccanismi di clearance alla base delle patologie intraneuronali indotte dalla SUS è l'attivazione dell'autofagia neuronale12.
Qui, delineiamo un processo sperimentale, mediante il quale vengono preparati anticorpi marcati fluorescentemente e quindi miscelati con microbolle a base lipidica interne, seguite da iniezione retroorbitale in topi anestetizzati. L'iniezione retroorbitale è un'alternativa all'iniezione della vena della coda che abbiamo trovato ugualmente efficace e più semplice da eseguire ripetutamente. Questo è immediatamente seguito dall'applicazione di SUS al cervello. Per determinare l'assorbimento terapeutico degli anticorpi, i topi vengono sacrificati e l'aumento della concentrazione di anticorpi nel cervello viene quindi quantificato. Come proxy del cambiamento nell'omeostasi cerebrale, l'attività fagocitica microgliale è determinata dall'istologia e dalla ricostruzione volumetrica 3D.
I dati generati suggeriscono che la somministrazione di ultrasuoni di anticorpi è un approccio potenzialmente attraente per il trattamento delle malattie neurodegenerative. Il protocollo può essere applicato in modo simile ad altri farmaci candidati, nonché a carichi modello come dextrans etichettati fluorescentemente di dimensioni definite14.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850365C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000]</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880128C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 antibody labeling kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A20186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68 antibody</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA1957GA</td>
			<td>Use 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>372978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Counter (Multisizer 4e)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Use 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11077</td>
			<td>Use 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>head holder (model SG-4N, Narishige Japan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1 antibody</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>Use 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>#8547008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflow flow solution</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B43905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infrared imaging system Odyssey Fc</td>
			<td>Licor</td>
			<td>2800-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octafluoropropane</td>
			<td>Arcadophta</td>
			<td>0229NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIPS (Therapy Imaging Probe System)</td>
			<td>Philips Research</td>
			<td>TIPS_007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of antibodies into the brain using focused scanning ultrasound

Solo una piccola frazione degli anticorpi terapeutici che colpiscono le malattie del cervello sono assorbiti dal cervello. L'ecografia focalizzata offre la possibilità di aumentare l'assorbimento di anticorpi e l'impegno attraverso l'apertura transitoria della barriera emato-encefalica (BBB). Nel nostro laboratorio, stiamo sviluppando approcci terapeutici per le malattie neurodegenerative in cui un anticorpo in vari formati viene consegnato attraverso la BBB utilizzando microbolle, in concomitanza con l'applicazione di ultrasuoni focalizzati attraverso il cranio mirando a più punti, un approccio a cui ci riferiamo come ecografia a scansione (SUS). Gli effetti meccanici delle microbolle e degli ultrasuoni sui vasi sanguigni aumentano il trasporto paracellulare attraverso la BBB separando transitoriamente le giunzioni strette e migliorano la transcitosi mediata dalle vescicole, consentendo agli anticorpi e agli agenti terapeutici di attraversarsi efficacemente. Inoltre, gli ultrasuoni facilitano anche l'assorbimento di anticorpi dal cervello interstiziale in cellule cerebrali come i neuroni in cui l'anticorpo si distribuisce in tutto il corpo cellulare e persino nei processi neuritici. Nei nostri studi, vengono preparati anticorpi marcati con fluorescenza, mescolati con microbolle a base lipidica preparate internamente e iniettati nei topi immediatamente prima che la SUS venga applicata al cervello. L'aumento della concentrazione di anticorpi nel cervello viene quindi quantificato. Per tenere conto delle alterazioni nella normale omeostasi cerebrale, la fagocitosi microgliale può essere utilizzata come marcatore cellulare. I dati generati suggeriscono che la somministrazione di ultrasuoni di anticorpi è un approccio interessante per il trattamento delle malattie neurodegenerative.

Utilizzando questo protocollo, gli anticorpi marcati con fluorescenza vengono consegnati al cervello e possono essere rilevati, insieme all'attivazione della microglia. La conclusione che si può trarre è che l'uso di ultrasuoni focalizzati e microbolle migliora notevolmente l'assorbimento cerebrale degli anticorpi e può fornire anticorpi a tutto il cervello o all'emisfero di un topo se usato in modalità di scansione. La Figura 1 mostra il dispositivo di applicazione a ultrasuoni TIPS (di...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound at JoVE.com

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Qui viene presentato un protocollo per aprire transitoriamente la barriera emato-encefalica (BBB) sia focalmente che attraverso un cervello di topo per fornire anticorpi marcati fluorescentemente e attivare la microglia. Viene inoltre presentato un metodo per rilevare la somministrazione di anticorpi e l'attivazione della microglia mediante istologia.

Consegna di anticorpi nel cervello utilizzando ultrasuoni a scansione focalizzata

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

delivery-antibodies-into-brain-using-focused-scanning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.0K Views.  The University of Queensland. Qui viene presentato un protocollo per aprire transitoriamente la barriera emato-encefalica (BBB) sia focalmente che attraverso un cervello di topo per fornire anticorpi marcati fluorescentemente e attivare la microglia. Viene inoltre presentato un metodo per rilevare la somministrazione di anticorpi e l'attivazione della microglia mediante istologia.

Video: Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. However, because the uterine wall is opaque during early embryogenesis, the ability to target specific parts of the embryo for microinjection is greatly limited. Fortunately, high-frequency ultrasound imaging permits the generation of images that can be used in real time to guide a microinjection needle into the embryonic region of interest. Here we describe the use of such imaging to guide the injection of retroviral vectors into the ventricular system of the mouse forebrain at embryonic day (E) 9.5. This method uses a laparotomy to permit access to the uterine horns, and a specially designed plate that permits host embryos to be bathed in saline while they are imaged and injected. Successful surgeries often result in most or all of the injected embryos surviving to any subsequent time point of interest (embryonically or postnatally). The principles described here can be used with slight modifications to perform injections into the amnionic fluid of E8.5 embryos (thereby permitting infection along the anterior posterior extent of the neural tube, which has not yet closed), or into the ventricular system of the brain at E10.5/11.5. Furthermore, at mid-neurogenic ages (~E13.5), ultrasound imaging can be used direct injection into specific brain regions for viral infection or cell transplantation. The use of ultrasound imaging to guide in utero injections in mice is a very powerful technique that permits the molecular and cellular manipulation of mouse embryos in ways that would otherwise be exceptionally difficult if not impossible.

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. Here we describe the use of high-frequency ultrasound imaging to guide the injection of retroviral vectors into the mouse brain at embryonic day (E) 9.5.

Ultrasound-Guided Microiniezione nel proencefalo mouse In Utero A E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

Ricerca

Neuroscienze

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infuso stereotassico di Oligomeric amiloide-beta nelle Hippocampus mouse

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Analisi di Brain mitocondri Utilizzando Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

Tecnica mouse Microchirurgia infusione per Targeted Sostanza consegna nel sistema nervoso centrale<i&gt; via</i&gt; Carotide interna

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an approach provides a safe delivery method by-passing the blood brain barrier (BBB), thus allowing treatment with therapeutics with poor BBB-permeability or those for which systemic exposure is not desired, e.g., due to toxicity. CED requires optimization of the catheter design, injection protocol, and properties of the infusate. With this protocol we describe how to perform CED of a solution containing up to 20 &#181;g of an antibody into the caudate putamen of mice. It describes preparation of step catheters, testing them in vitro and performing the CED in mice using a ramping injection program. The protocol can be readily adjusted for other infusion volumes and can be used for injecting various tracers or pharmacologically active or inactive substances, including chemotherapeutics, cytokines, viral particles, and liposomes.

Convection-enhanced delivery (CED) is a method enabling effective delivery of therapeutics into the brain by direct perfusion of large tissue volumes. The procedure requires the use of catheters and an optimized injection procedure. This protocol describes a methodology for CED of an antibody into a mouse brain.

Consegna di anticorpi nel cervello di Murine tramite consegna convezione-migliorato

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

Utilizzo della fluorescenza Near-Infrared e scansione ad alta risoluzione per misurare l'espressione proteica nel cervello del roditore

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic delivery including precise localization to a target brain region and reduction of off target side effects. However, stereotaxic surgery is highly invasive which limits its translational efficacy, requires long recovery times, and provides challenges when targeting multiple brain regions. Focused ultrasound (FUS) can be used in combination with circulating microbubbles to transiently open the blood brain barrier (BBB) in millimeter sized regions. This allows intracranial localization of systemically delivered agents that cannot normally cross the BBB. This technique provides a noninvasive alternative to stereotaxic surgery. However, to date this technique has yet to be widely adopted in neuroscience laboratories due to the limited access to equipment and standardized methods. The overall goal of this protocol is to provide a benchtop approach to FUS BBB opening (BBBO) that is affordable and reproducible and can therefore be easily adopted by any laboratory.

Focused ultrasound with microbubble agents can open the blood brain barrier focally and transiently. This technique has been used to deliver a wide range of agents across the blood brain barrier. This article provides a detailed protocol for the localized delivery to the rodent brain with or without MRI guidance.

Un approccio da banco all'apertura della barriera ematica specifica della posizione utilizzando ultrasuoni focalizzati in un modello di ratto

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

Un neuronavigation stereotattico guidato da immagini ad alta produttività e un sistema ad ultrasuoni focalizzati per l'apertura della barriera ematico-encefalica nei roditori

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly useful for disorders in which identifiable neuronal circuitry plays a key role, such as epilepsy and movement disorders. Currently available surgical modalities, while effective, generally involve an invasive surgical procedure, which can result in surgical injury to non-target tissues. Consequently, it would be of value to expand the range of surgical approaches to include a technique that is both non-invasive and neurotoxic.
Here, a method is presented for producing focal, neuronal lesions in the brain in a non-invasive manner. This approach utilizes low-intensity focused ultrasound together with intravenous microbubbles to transiently and focally open the Blood Brain Barrier (BBB). The period of transient BBB opening is then exploited to focally deliver a systemically administered neurotoxin to a targeted brain area. The neurotoxin quinolinic acid (QA) is normally BBB-impermeable, and is well-tolerated when administered intraperitoneally or intravenously. However, when QA gains direct access to brain tissue, it is toxic to the neurons. This method has been used in rats and mice to target specific brain regions. Immediately after MRgFUS, successful opening of the BBB is confirmed using contrast enhanced T1-weighted imaging. After the procedure, T2 imaging shows injury restricted to the targeted area of the brain and the loss of neurons in the targeted area can be confirmed post-mortem utilizing histological techniques. Notably, animals injected with saline rather than QA do demonstrate opening of the BBB, but dot not exhibit injury or neuronal loss. This method, termed Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery (PING) could provide a non-invasive approach for treating neurological disorders associated with disturbances in neural circuitry.

The goal of the protocol is to provide a method for producing non-invasive neuronal lesions in the brain. The method utilizes Magnetic Resonance-guided Focused Ultrasound (MRgFUS) to open the Blood Brain Barrier in a transient and focal manner, in order to deliver a circulating neurotoxin to the brain parenchyma.

Lesioni neuronali mirate per la disconnessione non invasiva dei circuiti cerebrali

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...