Il nostro protocollo è un test di visione per topi. È robusto e facile da replicare. Mentre sono disponibili molti test di visione del mouse, l'esperimento incombente è uno dei pochi metodi per testare la via di formazione dell'immagine, che non è un percorso riflesso visivo.
Mentre molti altri saggi sul comportamento visivo richiedono un ampio allenamento in chirurgia animale, la tecnica incombente richiede poco allenamento sperimentale. Inizia costruendo un involucro rettangolare a coperchio aperto utilizzando cornici in alluminio e pannelli in PVC per ospitare il mouse durante l'incombente presentazione degli stimoli visivi. Posare un foglio di carta per coprire l'intero pavimento dell'involucro per garantire una facile pulizia tra una prova e l'altro.
Quindi, aggiungi un rifugio opaco in un angolo del recinto con un ingresso rivolto verso il centro dell'arena per un facile ingresso e uscita. Fissare una fotocamera con un obiettivo grandangolare a un supporto montato sul tavolo adiacente all'involucro per catturare il comportamento del mouse. Configurare quindi un monitor del computer sopra l'enclosure.
Prepara un modello incombente utilizzando un software sperimentale per codificare un cerchio nero in espansione. Impostare lo stimolo per iniziare dall'angolo visivo di due gradi ed espandersi a 50 gradi in 250 millisecondi e impostare il codice per ripetere lo stimolo 10 volte con un intervallo di un secondo. Inizia selezionando un topo per l'esperimento e tre topi ciechi per garantire che la risposta allo stimolo incombente fosse davvero un comportamento visivamente guidato.
Posizionare il topo sano nel recinto e lasciarlo esplorare liberamente l'ambiente circostante per sette-15 minuti prima dell'inizio dello stimolo. 10 secondi prima della stimolazione, avviare l'acquisizione video sulla fotocamera. Una volta che il mouse è lontano dal rifugio e si muove liberamente nell'arena aperta, inizia gli incombenti stimoli visivi.
Infine, trasferisci di nuovo il mouse nella sua gabbia originale. Pulire l'involucro per il mouse successivo spruzzando le pareti e rifugiarsi con il 70% di etanolo e pulerlo e sostituire il rivestimento del pavimento di carta, se sporco. Riposizionare il rifugio nella stessa posizione iniziale se spostato durante il trasferimento degli animali e la pulizia dell'involucro.
Al computer, salvare il video clip per ogni mouse in formato AVI senza compressione dei file al fine di garantire nessuna perdita di dati durante il trasferimento al software di analisi. Quindi, usa il software di analisi per tracciare il movimento dell'animale intorno all'arena prima, durante e dopo la presentazione dello stimolo. Calcola la velocità e la distanza del mouse dal rifugio.
Se l'immagine dell'arena è distorta a causa dell'angolo video, correggere la coordinazione x e y prima del calcolo. Infine, confronta i parametri prima e dopo l'insorgenza dello stimolo incombente per determinare come il mouse ha risposto agli stimoli. Che si tratti di congelare, fuggire o non mostrare alcun cambiamento nel comportamento.
I video clip acquisiti sono stati analizzati utilizzando un software di analisi commerciale con una funzione di tracciamento manuale. Utilizzando la funzione di tracciamento, la posizione del mouse è stata identificata in ogni fotogramma del video prima, durante e dopo gli stimoli incombenti. Quando si è verificato il volo, la velocità è aumentata bruscamente e la distanza dal rifugio si è ridotta di conseguenza.
Al contrario, la velocità era vicina a zero millimetri al secondo quando i topi si congelarono. La velocità fu ridotta rispetto al controllo prima di incombere e la distanza dalla cupola non cambiò durante questo periodo. È importante ricordare di ottenere una linea di base del movimento prima dell'inizio dello stimolo o una reazione quantitativa allo stimolo non può essere determinata.
È importante condurre più test per una valutazione accurata della visione. Pupil light reflex è un metodo comunemente usato, che assicura che il mouse abbia occhi sani. Il meccanismo della risposta incombente non è pienamente compreso.
Questa tecnica può fornire opportunità per esplorare meccanismi di riconoscimento degli oggetti in movimento e risposte di paura per i neuroscienziati.
