Le cellule muscolari lisce detrusor formano la parete della vescica urinaria che alla fine facilita l'annullamento e la conservazione delle urine. Il nostro protocollo fornisce un metodo convalidato e affidabile per l'isolamento fresco di singole cellule muscolari lisce. Il detrusore umano appena isolato cellule muscolari lisce offre l'opportunità di esami elettrofisiologici e molecolari a livello di singola cellula.
Studiando singole cellule muscolari lisce detrusori dal controllo, vesciche urinarie umane normali e mas diseased, abbiamo l'opportunità di convalidare obiettivi farmacologici come i canali ionici. Le singole cellule muscolari lisce del detrusore umano sono ideali per esperimenti elettrofisiologici come l'elettrofisiologia patch-clamp. Qui presenteremo un esempio di studio di un singolo canale ionico chiamato TRPM4, potenziale recettore transitorio melastatina a quattro canali, che è un canale di catione non selezionativo.
I principianti possono avere difficoltà con la dissezione e le fasi di trattamento enzimatico che richiedono efficienza e familiarità, incluso il riconoscimento di passaggi importanti critici per ottenere nuove cellule DSM isolate. È importante avere familiarità con l'istologia della vescica umana, i passaggi del protocollo per isolare le singole cellule rimangono resilienti e inizialmente si aspettano di ottenere cellule non ottili usando questo protocollo. Iniziare esaminando l'intero spessore del campione della vescica urinaria.
Inchiodare l'esemplare, la mucosa rivolta verso l'alto e la serosa su un piatto rotondo in silicone rivestito di enantiomero da 150 mm riempito con DS ghiacciato e rimuovere con cura tutta la mucosa con dissezione affilata. Ritaglia diversi pezzi di muscolo liscio o dsm senza mucosa. Posizionare da tre a sei pezzi DSM in un tubo con uno o due millilitri di DS pre-riscaldato contenenti papaina e ditiothreitol, o DS-P.
Incubarli a 37 gradi Celsius per 30-45 minuti, assicurandosi di scuotere il tubo ogni 10-15 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere il DS-P dal tubo e lavare brevemente i pezzi DSM con DS ghiacciato. Trasferire il DS con i pezzi DSM su un nuovo tubo e rimuovere il DS, lasciando i pezzi DSM nella parte inferiore del tubo. Aggiungere uno o due millilitri di DS contenenti collagenasi di tipo II, o DS-C, al tubo.
E incubarlo a 37 gradi Celsius con occasionali scosse. Scartare il DS-C e lavare i pezzi DSM trattati con enzimi da cinque a 10 volte con DS ghiacciato. Dopo l'ultimo lavaggio lasciare il DS all'interno del tubo e triturare delicatamente i pezzi con una pipetta Pasteur lucidata a fuoco per rilasciare singole celle DSM. Pipetta da 0,25 a un millilitro di sospensione cellulare su una camera inferiore di vetro seduta sul palco di un microscopio invertito e incubarla per almeno 45 minuti per consentire alle cellule di aderire.
Quindi, rimuovere il DS dal bagno e sostituirlo con la soluzione E tramite superfusione. Tirare più elettrodi patch, lucidare il fuoco le punte degli elettrodi e rivestire le punte in cera dentale, se necessario. Riempire la punta di un elettrodo patch con la soluzione di pipetta senza ampotericina-B immergere brevemente l'elettrodo nella soluzione.
Il successo dell'elettrofisiologia del morsetto del cerotto dipende dalla qualità delle cellule DSM e dalla solubilizzazione dell'ampotericina-B. Riempire l'elettrodo con la stessa soluzione di pipetta contenente ampotericina-B e montare l'elettrodo su un supporto collegato a uno stadio di testa dell'amplificatore del morsetto patch. Utilizzare un micromanipolatore per posizionare l'elettrodo appena sotto la superficie della soluzione extracellulare in modo che la punta dell'elettrodo sia appena sommersa.
Quindi, determinare la resistenza dell'elettrodo utilizzando la funzione della finestra di prova della membrana del software di acquisizione commerciale e far avanzare l'elettrodo verso la cella di interesse. Quando si tocca la superficie cellulare con l'elettrodo, formare un giga-sigillo applicando una leggera pressione negativa rapida all'elettrodo tramite tubi. Ciò si traduce in una pressione negativa sulla punta dell'elettrodo con conseguente giga-tenuta di successo come confermato dal test della membrana.
Lasciare da 30 a 60 minuti affinché l'ampotericina-B si dissolva lungo la pipetta e venga inserita nella membrana plasmatica, formando pori principalmente selettivi a formazioni monovalenti. Continuare a monitorare il giga-sigillare con la funzione di test della membrana. Quando la perforazione del cerotto è ottimale, annullare i transitori di capacità regolando i quadranti per la capacità cellulare e la resistenza in serie sull'amplificatore.
Una volta osservate le correnti di catione a fase di tensione stabile, registrare le correnti con il protocollo del passaggio della tensione di instradamento come descritto nel manoscritto. Applicare un composto o una condizione fisiologica di prova per testare per superfusione e registrare le risposte per le condizioni di controllo e test, nonché il lavaggio. Questo protocollo può essere utilizzato per isolare cellule DSM sane e fresche per studi funzionali e molecolari.
Le singole cellule DSM sane sono caratterizzate da morfologia a forma di mandrino, bordi nitidi e ben definiti, un alone ben definito intorno alla cellula e aspetto semi-contrattile se visti al microscopio. Inoltre, le cellule DSM appena isolate rispondono alla stimolazione meccanica e al carbacholo. Frammenti cellulari e cellule non vitali o sovradigerite dovrebbero essere evitati nei successivi esperimenti di patch-clamp.
Le celle isolate sono state utilizzate in esperimenti di patch-clamp perforati ampotericina-B in cui le correnti intere cellulari sono state misurate con un protocollo indotto a gradini di tensione o a rampa in tre diverse cellule DSM umane. Esperimenti hanno rivelato che il 9-fenanthrolo, un inibitore del canale TRPM4, ha inibito efficacemente e reversibilmente le correnti di catione DSM umano. La componente di corrente sensibile al 9-fenanthrolo illustra una più forte inibizione a tensioni positive e rettifica verso l'esterno.
Condizione delle fasi di trattamento enzimatico, i passaggi 2.2 e 2.3, compresa la temperatura, la durata dei trattamenti enzimatici, le fonti di lotto enzimatico e la qualità delle cellule DSM, sono determinanti chiave per ottenere cellule DSM umane di alta qualità. Le cellule DSM umane sono ideali anche per valutare i livelli di secondo messaggero intracellulare tra cui calcio e AMP ciclico, rilevare le espressioni proteiche per immunocitochimica e co-espressione mediante test di contenzioso prossimale in situ e espressione di mRNA da RT-PCR, qRT-PCR, microarray e sequenziamento di nuova generazione. Le cellule DSM umane hanno avanzato la nostra comprensione dei ruoli dei canali BK, calcio, TRPM4 nella vescica urinaria.
Gli sviluppi futuri consentiranno di collegare specificamente le proprietà elettrofisiologiche o farmacologiche con i profili del trascritoma o del proteoma.
