La Wellcome Trust ha fornito sostegno finanziario (Premio VIP per JSY e 074128 Research Fellowship a KLB). Medical Research Council Studentship a RJA Leica_SP2_Stacker, un algoritmo utilizzato per importare TIFF per la &#39;ricostruzione&#39; in una serie, si basa su Leica_tiff_sequence, un plugin per leggere Leica TIFF SP2 in ImageJ, sviluppato da Tony Collins e utilizzato con il suo permesso. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg e TurboReg, gli algoritmi usati per correggere il movimento del tessuto, si basano su Th venaz e colleghi (1998) 9. Excel_writer.jar è stata scritta da Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html). JNCT0.08JoVE.ijm, l&#39;algoritmo di rilevamento delle particelle, si basa su un algoritmo scritto da Brain KL e dettagliata in precedenza 5.

Parte 1: Preparazione del Ca 2 + indicatore (Oregon verde 488 Bapta-1 AM) <ol><li> Oregon verde 488 Bapta AM-1 arriva in 500 fiale microlitri come una piccola quantità (50 mg) di polvere. Aggiungere 40 microlitri Pluronic F-127 la soluzione alla polvere, agitando dolcemente per 30 s, quindi aggiungere 460 microlitri PSS, e agitare delicatamente per 30 s. La soluzione finale, 10 mM Oregon verde 488 Bapta-1 AM, dispone di 4 x 125 microlitri aliquote. Evitare l&#39;esposizione alla luce e conservare a -20 C. </li></ol> Parte 2: Ca 2 + carico <ol><li> Rimuovere l&#39;indicatore di Ca 2 + (Oregon verde 488 Bapta-1 AM) dal (-20 C) freezer e lasciare scongelare a temperatura ambiente. </li><li> Prendere 1 ml di PSS in una provetta e porre in bagnomaria. Bubble con% O 95 2 / 5% di CO 2 a una velocità di circa 1 bolla che appaiono al secondo. Il gorgogliatore ha bisogno di essere fissato alle provetta, ad esempio con un tappo o con Parafilm. </li><li> Sezionare il tessuto dall&#39;animale e, in un Sylgard alberato capsula di Petri, con attenzione rimuovere il tessuto connettivo. Indipendentemente dal tipo di organo muscolo liscio, PSS deve essere sostituito ogni 10 minuti e dei tessuti devono essere lavati bene (per esempio sostituendo il PSS tre volte) dissezione seguente. Per il dotto deferente: considerare l&#39;organo di taglio lunghezza modi per produrre un foglio di tessuto. Per la vescica urinaria: aperta longitudinalmente dal collo della vescica (posteriore) alla sommità della cupola (anteriore). Preparare quattro strisce, 6 - 8 mm di lunghezza e 1 - 2 mm di larghezza, lungo la superficie dorsale del detrusore, tagliando in direzione dei fasci muscolari dominante. </li><li> Luogo sezionato tessuto nel &#39;pre-riscaldato e bolle&#39; PSS. </li><li> Aggiungere 125 ml di 10 micron Oregon verde 488 Bapta-1 AM alla provetta e dare una piccola scossa, a mano, per mescolare. </li><li> Riprendi bolle e lasciare, coperto con un foglio. Il tempo è necessario per il tessuto sufficiente a raccogliere la Ca 2 + indicatore varia con le dimensioni del tessuto e lo spessore dello strato di muscolatura liscia. Per esempio: 70 minuti (mouse detrusore, anococcygeus ratto) a 120 minuti (detrusore ratto, topo vas deferente). </li></ol> Parte 3: Preparazione del &#39;Ca 2 + caricato&#39; dei tessuti per la microscopia Pinning attenta del tessuto è necessaria per ridurre al minimo movimento spontaneo del tessuto (una proprietà di imaging di cellule muscolari lisce dal tessuto relativamente intatto) e per facilitare la posizione di un sito idoneo per l&#39;imaging (come un pezzo di tessuto può essere intervistati in due dimensioni, invece di tre). <ol><li> Lavare il tessuto in PSS bollito per almeno 5 minuti. </li><li> Montare a Sylgard alberati piatto preparazione, l&#39;allungamento dei tessuti (leggermente) per formare una lamiera piana. Evitare di utilizzare lungo &#39;spine&#39;, che potrebbero graffiare l&#39;obiettivo, usare lunghezze invece brevi di 25-50 micron di diametro filo d&#39;argento come &#39;pin&#39; e inserire in un angolo. </li><li> Posizionare il piatto preparato sul palco microscopio, facendo attenzione a garantire che il PSS non sfugge dalla Sylgard alberato zona del piatto (in quanto ciò potrebbe portare ad una vasta area è coperta di PSS, quando il superfusione comincia). </li><li> Accendere la pompa per superfuse la preparazione con PSS. Un tasso di 100 ml per ora è spesso impiegato. </li><li> Accendere l&#39;apparecchio riscaldatore. </li><li> Posizionare i tubi di afflusso e deflusso e sonda di temperatura sul piatto preparato (apposizione ciascuno per la striscia di metallo dal magnete sulla sua base). L&#39;altezza della punta del tubo di efflusso determina la profondità del PSS. Fare attenzione per assicurare che il deflusso è in realtà la rimozione PSS (come a volte non inizialmente). </li><li> Impostare la temperatura dell&#39;unità di riscaldamento per raggiungere la temperatura desiderata, ad es 33-35 C. </li><li> Lasciare che il tessuto si stabilizzi per almeno 10 minuti. </li></ol> Parte 4: Selezione del sito di immagine L&#39;esposizione a luce di eccitazione si photobleach l&#39;indicatore, in modo da evitare di usare per più di pochi secondi alla volta. <ol><li> Con un obiettivo a basso ingrandimento (10x o 20x) l&#39;uso a epifluorescenza, emozionante con una luce blu, per visualizzare la muscolatura liscia e di individuare una zona adatta per il monitoraggio. Provate a prendere un sito basato su: movimento (che dovrebbe essere minima) e il numero di cellule muscolari lisce del settore. Brillante &#39;strutture&#39; potrebbe causare un elevato numero di &#39;falsi positivi&#39; nel algoritmo di rilevamento di immagini, in modo da evitare siti con un gran numero di (ad esempio), le cellule epiteliali intervallati o fibroblasti. </li><li> Passa a un obiettivo di potenza superiore (40x). </li><li> Ruotare il palco o l&#39;asse ottico così la cellula del muscolo liscio (s) è orizzontale (cioè parallela all&#39;asse scansione rapida). </li></ol> Parte 5: microscopia confocale I dettagli di come il microscopio confocale è &#39;set up&#39; sono specifici per ogni tipo di microscopio, male considerazioni chiave sono: velocità (minimo di 5 Hz è necessario per la maggior parte transitori di Ca 2 +), la risoluzione e le dimensioni del campo (due delle quali sono negoziate-off con la velocità). Alcune delle seguente protocollo è specifico per un microscopio confocale Leica SP2 verticale. Un protocollo tipico è: 100 serie telaio, acquisita a 5 Hz (256 x 256 pixel, circa 100 x 100 micron.) O 13,5 Hz (256 x 64 pixel; circa 100 x 25 micron).. La testa di scansione impostato a muoversi in modo bidirezionale (per massimizzare la velocità di acquisizione) e di acquisire a 1000 Hz per riga. <ol><li> Chiudere il foro stenopeico ad un &#39;disco arioso&#39;. </li><li> Impostare la (488 nm) potenza del laser tra il 25 e il 35% sul AOTF, questo valore è un compromesso tra luminosità e photobleaching. (Quest&#39;ultimo è un problema particolare durante lunghe registrazioni.) </li><li> Acquisire sei serie per ogni sito, e 4-6 siti per &#39;trattamento&#39;. E &#39;comune a scopo di monitorare gli stessi sei siti pre-droga (&#39; controllo &#39;, cioè) e post-droga, anche se photobleaching significative potrebbe causare lo sperimentatore di deviare da questa. </li><li> E &#39;essenziale con Ca 2 + imaging che&#39; controlla il tempo &#39;sono eseguite. </li></ol> Parte 6: Preparazione per l&#39;analisi <ol><li> Scaricare e installare J Immagine da: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Scarica la piattaforma versione specifica, e quindi aggiornare alla versione più recente scaricando l&#39;ultimo file imageJ.jar da http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar, sostituendo il vecchio file. Gli utenti Apple Mac: se si fa girare lentamente, assicurarsi di utilizzare l&#39;ultima versione della Java Virtual Machine (JVM) disponibili da Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/). </li><li> Scarica Excel_writer.jar da: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html e installare il plug-in [directory] jar&gt; directory. </li><li> Copiare i seguenti file nella cartella Plugins: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Installare ognuno di questi script utilizzando il plugin [Menu]&gt; Macro&gt; Installa ... funzione di ImageJ. </li><li> Usiamo un microscopio confocale Leica SP2, il software (Leica LCS) per la quale genera ogni serie come un unico visibile &#39;film&#39; all&#39;interno del software, ma consente di risparmiare come singoli fotogrammi. Per ricostruire fotogrammi in serie: (i) Assicurarsi che tutti i &#39;fotogrammi&#39; essere ricostruito in una singola cartella (ad esempio &#39;DataFolder&gt; TIFF&#39;). (Ii) Selezionare Plugin [Menu]&gt; Macro&gt; Leica_SP2_Stacker. Selezionare la directory radice (ad esempio &#39;DataFolder&#39;). Selezionare la cartella desiderata dal menu a tendina (ad esempio &#39;TIFF /&#39;). Selezionare una directory di output o generare una nuova (&#39;DataFolder&gt; Stack&#39;, ad esempio). Lo script sarà poi ricostruire serie di singoli fotogrammi. </li></ol> Parte 7: Correzione per il movimento Anche se il movimento del sito ripreso può essere minimizzato con una buona pinning e tessuti in modo uniforme-allungato, alcuni organi muscolari lisce presentano contrazioni spontanee che non può essere abolito da un&#39;attenta pinning da solo. Qui si descrive l&#39;uso di un algoritmo liberamente disponibile che si allinea o partite frame all&#39;interno di una serie. <ol><li> Download &#39;StackReg&#39; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) e &#39;TurboReg&#39; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). </li><li> Installare ogni plugin nella directory usando il Plugin&gt; Macro&gt; Installa ... </li><li> Caricare una risma da elaborare (File&gt; Apri ...) e poi passare a un fotogramma che mostra chiaramente il campo di interesse. Altri fotogrammi sarà allineato a questo sistema di riferimento. </li><li> Plugins&gt; Stack&gt; StackReg. Provare a ciascuno dei diversi &#39;Trasformazioni&#39; (Traduzione cioè, corpo rigido, in scala di rotazione, affine) per determinare ciò che è più efficace. (Ulteriori dettagli: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) </li></ol> Parte 8: algoritmo di rilevamento delle particelle Per ogni &#39;sito&#39; ripreso, i fattori di varia che influenzano la rilevazione di Ca 2 + transitori. Misurando alcune proprietà di ciascun sito (&#39;parametri delle particelle&#39; - sotto dettagliato), il processo di rilevazione è facilitato. Così per ogni sito, si calcola &#39;soglia per sottratta&#39; &#39;soglia per il rapporto&#39;, e &#39;la soglia limite di cella&#39;. <ol><li> Plugin [Menu]&gt; Macro&gt; Installa ... e selezionare &#39;JNCT0.08Release.ijm&#39;. </li><li> Plugin [Menu]&gt; Macro&gt; pila di carico (scorciatoia: l). Selezionare una serie e calcolare i parametri delle particelle: <ol style="list-style:none;"><li> a. Soglia per la sottratto (sfondo =) </li></ol></li><li> Selezionare un ROI rettangolare su ciò che si crede di essere &#39;background&#39;. </li><li> Misura (scorciatoia: m). Annotare MEDIA. <ol style="list-style:none;"><li> b. Soglia di calcolo per il rapporto </li></ol></li><li> Selezionare una forma rettangolareROI intorno ad una zona otticamente piatto della cella (s). </li><li> Misura (scorciatoia: m). Nota DEVIAZIONE giù media e standard. </li><li> Ripetere altre due volte o è possibile disegnare tre caselle in una sola volta premendo &#39;turno&#39;. </li><li> Calcolare e annotare la soglia per il rapporto = (1 + SD / media) x 32, con una media dei valori delle tre replicazione / siti. <ol style="list-style:none"><li> c. Cellula bordo Soglia </li></ol></li><li> Immagine&gt; Pile&gt; Z progetto ... Scegli il tipo di proiezione: &#39;intensità media&#39; </li><li> Immagine&gt; Regolazioni&gt; Soglia. </li><li> Seleziona bianco e nero. </li><li> Definire &#39;sotto&#39; (cursore superiore) limite e annotare il valore corrispondente (a destra del cursore). Solo gli eventi che si verificano nelle regioni nero saranno conteggiati. </li><li> Fare clic su &#39;reset&#39;. </li><li> Analizzare le pile (scorciatoia: 2) </li><li> Selezionare una sola serie in questa fase, cioè il &#39;primo file&#39; e &#39;ultimo file&#39; dovrebbe essere la stessa. </li><li> Immettere i valori di &#39;soglia per sottratta&#39; &#39;soglia per il rapporto&#39;, e &#39;la soglia limite di cella&#39;. Lasciare le altre impostazioni ai loro valori di default. </li><li> L&#39;algoritmo produce un doppio vetro di una finestra in cui viene mostrata la serie di trattati sulla sinistra e l&#39;originale sulla destra. Attentamente passare attraverso questo per valutare il numero di falsi positivi e le occasioni in cui gli eventi, visibile ad occhio, non sono stati rilevati. Per ottenere una maggiore accuratezza nel rilevamento di Ca 2 + transitori può essere necessario modificare leggermente alcuni &#39;parametri delle particelle&#39;. Mentre il processo può sembrare un po &#39;colpo di fortuna&#39; al primo tentativo, si ha subito una sensazione di ciò che i parametri sono fondamentali. </li><li> Per ogni serie, l&#39;algoritmo produce un file di Excel che le caratteristiche particolari della manifestazione rilevato (come ampiezza, area e posizione). &#39;Falsi positivi&#39; - identificato esaminando i file di immagine che le uscite algoritmo (ad esempio, passo 8.17) - possono essere rimosse, a mano, da questo file di Excel. </li></ol>

<ol>
	<li>Haugland, R. P., Gregory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indicators+for+Ca2+,+Mg2+,+Zn2++and+other+metal+ions.">Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions.</a> Handbook of fluorescent probes and research products. , 771-826 (2002).</li><li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+force+and+Ca2++in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse.">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li><li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder.">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li><li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+purinergic+Ca2++transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle.">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li><li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2++transients+in+mouse+vas+deferens.">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li><li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases.">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li><li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder.">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li><li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks.">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li></ol>

Si è cercato di minimizzare il numero di animali usati e la loro sofferenza; tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con gli animali nel Regno Unito (Scientific Procedure) Act del 1986 e delle Comunità europee la direttiva del Consiglio 86/09/EEC.

Scelta di fluorescente Ca 2 + indicatore Oregon verde 488 Bapta-1 AM è stata scelta come indicatore di Ca 2 + perché (i) è brillante rispetto ad altri indicatori (ad esempio Fluo-4 e Green calcio) 1, (ii) è sensibile ai cambiamenti fisiologici nella concentrazione Ca 2 + con una K d di grandezza simile 1 al intracellulare di Ca 2 + concentrazione [Ca 2 +] i (es. vasi deferenti 2), (iii) i carichi molte cellule muscolari lisce, consentendo cellule della muscolatura liscia accoppiamento da monitorare. Tuttavia, Oregon verde 488 Bapta-1 AM è un non-ratioable Ca 2 + indicatore, e come tale non può essere facilmente utilizzato per determinare l&#39;assoluto [Ca 2 +] i. Inoltre, può anche buffer di Ca 2 + se sono presenti in concentrazioni elevate e si satura con i cambiamenti di ampiezza elevata [Ca 2 +] i. L&#39;inibizione della contrattilità spontaneo La contrattilità spontaneo degli organi muscolo liscio può essere ridotta farmacologicamente, come ad esempio bloccando il movimento di Ca 2 + attraverso la L-type Ca 2 + canali (ad esempio: nifedipina 3; diltiazem 4). Si noti che questi farmaci ridurrà di molto l&#39;ampiezza delle cellule intere Ca 2 + flash / transitori. Contrazione dei vasi deferenti risultati da una combinazione di neurotrasmissione principalmente purinergici e noradrenergico. Focali transitori Ca 2 + in questo tessuto sono, tuttavia, insensibili al blocco dei recettori noradrenergici (ad esempio α 1 adrenergico, da prazosina 5) in modo movimento può essere ridotto senza compromettere focale Ca 2 + transitori. In alternativa, la contrazione può essere prevenuto &#39;a valle&#39; attraverso l&#39;inibizione della chinasi della catena leggera ad esempio miosina da wortmannina 6. Conclusioni Monitoraggio Ca 2 + di fluorescenza a risoluzione di submicron è una tecnica potente per lo studio post-giunzionale effetti rilascio di neurotrasmettitore 5,7 e il rilascio di Ca 2 + dai depositi interni (ad esempio &#39;scintille&#39; 8). L&#39;analisi di Ca 2 + transitori utilizzando il metodo descritto qui è costo-efficace rispetto ai pacchetti di immagini disponibile in commercio e permette l&#39;analisi su misura attraverso l&#39;analisi personalizzata scritta plugin Java per ImageJ.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O6807</td>
<td>10 x 50 &mu;g</td>
</tr>
<tr>
<td>Pluronic F-127 solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>20% solution in DMSO</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica SP2 upright confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Air table (&#x2018;vibration isolated workstation&#x2019;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Newport</td>
<td>M-VW-3046-OPT-012140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 elastomer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

focal ca2+ transient detection in smooth muscle

Ca 2 + immagini della muscolatura liscia permette di comprendere meglio i meccanismi cellulari che non possono tradursi in variazioni del potenziale di membrana, come il rilascio di Ca 2 + dai depositi interni, e permette più celle di monitorare contemporaneamente di valutare, per esempio, giunto a tessuto sinciziale. Subcellulare Ca 2 + transitori sono comuni nella muscolatura liscia, ma sono difficili da misurare con precisione a causa dei problemi causati dal loro verificarsi stocastico, spesso su un campo ampio, in un organo che è soggetta a contratto. Per superare questo problema, abbiamo sviluppato una serie di protocolli di imaging e di routine di analisi per acquisire e poi analizzare, in modo automatico, l&#39;ubicazione, la frequenza e l&#39;ampiezza di tali eventi. Se questo approccio può essere applicato in altri contesti, il nostro lavoro comporta l&#39;individuazione di locali purinergici Ca 2 + transitori per l&#39;individuazione di rilascio del trasmettitore con risoluzione di submicron. ATP è rilasciato come cotransmitter da nervi autonomi, dove si lega a recettori P2X1 sulla muscolatura liscia del detrusore e vasi deferenti. Ca 2 + entra nella muscolatura liscia, con conseguente purinergici neuroeffector Ca 2 + transitori (NCTS). La focale di Ca 2 + transitori permettono il monitoraggio ottico di rilascio dei neurotrasmettitori in un modo che ha molti vantaggi rispetto elettrofisiologia. A parte la risoluzione spaziale molto migliorato, registrazione ottica ha il vantaggio aggiuntivo di permettere la registrazione di rilascio del trasmettitore da molti siti distinguibili contemporaneamente. Inoltre, il piano ottico di messa a fuoco è più facile da mantenere o correggere durante la serie lunga registrazione che è il riposizionamento di un microelettrodo intracellulare taglienti. In sintesi, un metodo per l&#39;imaging di Ca 2 + fluorescenza si delinea che i dettagli della preparazione del tessuto, e l&#39;acquisizione e l&#39;analisi dei dati. Delineiamo l&#39;utilizzo di script diversi per l&#39;analisi di tali Ca 2 + transitori.

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Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Dettagli di metodi ad alta risoluzione Ca<sup&gt; 2 +</supImmagini&gt; della muscolatura liscia all&#39;interno organi isolati, tra cui: la preparazione di acquisto, immagine tessuti e l&#39;analisi dei dati.

Focale Ca 2 + Rilevamento transitoria nel muscolo liscio

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

focal-ca2-transient-detection-in-smooth-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

11.2K Views.  University of Oxford. Dettagli di metodi ad alta risoluzione Ca 2 + della muscolatura liscia all'interno organi isolati, tra cui: la preparazione di acquisto, immagine tessuti e l'analisi dei dati.

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Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

Isolamento di cellule umane ombelicale muscolatura liscia arteriosa (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Ricerca

Biologia

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Esplorare arteriosa Muscolo liscio KV7 Funzione canale del potassio con morsetto Elettrofisiologia Patch e Myography pressione

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

Isolamento di polmonare cellule muscolari lisce di topi neonati

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Misura di Smooth funzione muscolare nei isolato carta igienica-applicazioni Farmacologia Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

A due fotoni Imaging di Intracellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipolazione e l&#39;ossido nitrico Produzione in endoteliale e della muscolatura liscia cellule di un isolato Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Misura di fluttuazioni calcio all&#39;interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

L&#39;isolamento di Murine coronarica vascolari cellule muscolari lisce

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

Lesione aortica di crusca a murina: un efficace<em&gt; In Vivo</em&gt; Modello di proliferazione cellulare liscia e funzione endoteliale

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

Misurazione della proliferazione delle cellule muscolari lustiche vascolari utilizzando la chimica dei clic

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in the aorta and regulates vasoconstriction and vasodilation. Mutations in genes encoding for the SMC contractile apparatus proteins are associated with aortic diseases, such as thoracic aortic aneurysms. Measuring SMC contraction in vitro is challenging, especially in a high-throughput manner, which is essential for screening patient material. Currently available methods are not suitable for this purpose. This paper presents a novel method based on electric cell-substrate impedance sensing (ECIS). First, an explant protocol is described to isolate patient-specific human primary SMCs from aortic biopsies and patient-specific human primary dermal fibroblasts for the study of aortic aneurysms. Next, a detailed description of a new contraction method is given to measure the contractile response of these cells, including the subsequent analysis and suggestion for comparing different groups. This method can be used to study the contraction of adherent cells in the context of translational (cardiovascular) studies and patient and drug screening studies.

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

This paper describes an explant culture-based method for the isolation and culturing of primary, patient-specific human aortic smooth muscle cells and dermal fibroblasts. Furthermore, a novel method is presented for measuring cell contraction and subsequent analysis, which can be used to study patient-specific differences in these cells.

Isolamento delle cellule muscolari lisce aortiche primarie specifiche del paziente e misurazioni semiquantitative di contrazione in tempo reale in vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...