De-lib-er-ating un prodotto CAR T Cell con competenza funzionale che si innesta, prolifera e ha attività cit-el-uric dopo l'infusione è un componente chiave di un'efficace immunoterapia adottiva. Ad esempio, nei tumori solidi, le cellule CAR T possono penetrare nei tumori solidi e ricevono una stimolazione antigene ottimale;tuttavia, il loro innesto generale e la proliferazione sono ostacolati nelle persone. Il vantaggio principale di questo approccio è che può mantenere la qualità delle cellule CAR T o lo stato di differenziazione delle cellule CAR T senza generare cellule T terminalmente differenziate o esauste, il che avrebbe diminuito la capacità proliferativa o scarsa funzione efficace dopo l'infusione.
Questa tecnica può essere difficile perché le cellule T sono molto sensibili alla loro concentrazione cellulare o alla superficie dei vasi in cui sono coltivate. Così come i loro bisogni metabolici. Essenzialmente le cellule T devono essere mantenute felici durante tutto il processo, altrimenti non cresceranno.
Per iniziare questa procedura, impostare piatti di cultura a 6 pozzi. Attivare cellule T umane primarie fresche o crioconviate mescolandole con perline magnetiche CD28 anti-CD3, con un rapporto di tre perline per cellula T nei pozzi dei piatti di coltura. Coltura delle cellule T in mezzo X-Vivo 15 integrata con siero AB umano normale, L-glutammina, he-pees e IL2.
Attivare le cellule T ad una concentrazione di un milione di cellule T per millilitro durante l'espansione. E culturarli a 37 gradi Celsius con il 20% di ossigeno, il 5% di anidride carbonica e il 95% di umidità. Dopo la stimolazione notturna, aggiungere supernaganti lentivirali alle cellule T attivate.
Calcola il volume di supernanti necessario per raggiungere una molteplicità di infezione tra tre e cinque. Continuare a coltivare le cellule usando le stesse condizioni. Il terzo giorno, raccogliere un'aliquota rappresentativa delle cellule di crioconservazione.
Prima della crioconservazione, rimuovere le perline magnetiche tubazioni e separando magneticamente. Preparare il supporto di congelamento, che contiene PBS con 0,5%DMSO. E conservalo a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'uso.
Quindi, centrifugare le cellule T a 300 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante e aggiungere cinque millilitri di PBS. Centrifugare nuovamente le cellule a 300 volte G per cinque minuti e scartare il PBS.
Sospendiamo il pellante in un millilitro di mezzo freddo per la crioconservazione. Congelare le cellule T in un contenitore di congelamento refrigerato. E conservare a meno 80 gradi Celsius per 48 ore.
Successivamente, trasferire le cellule congelate in azoto liquido. Lavare il resto delle cellule T una volta in cinque millilitri di PBS per eliminare qualsiasi vettore residuo. Centrifuga a 300 volte G per cinque minuti.
Quindi, decantare il PBS e sospendere di nuovo il pellante cellulare nel mezzo di coltura cellulare T ad una concentrazione di 500.000 cellule per millilitro. Dividi le cellule T in due culture progettate 45 e nove. Contare le cellule T per citometria a flusso usando perline di conteggio e anticorpi monoclonali per CD4 e CD8 umani.
Così come un colorante di vitalità. Rialimentare le colture a giorni nostri per mantenerle a una concentrazione di 500.000 cellule per millilitro. Il quinto giorno, conta e crio-conserva le cinque culture del giorno come descritto in precedenza.
Il settimo giorno, lavare 500.000 cellule in PBS. E sospenderli di nuovo in 100 microlitri di tampone di smistamento cellulare attivato a fluorescenza. Quindi, rilevare l'espressione della proteina superficiale CAR mediante colorazione immuno-coniata fluorescentmente anti-CAR 19 di tipo idio per citometria a flusso.
Il primo giorno contano e crio-conservano le nove culture del giorno come descritto in precedenza. In questo studio vengono misurate la funzione e l'efficacia delle cellule CAR T che vengono raccolte a intervalli variabili in tutta la coltura X-Vivo. Utilizzando i metodi descritti in questo video, le cellule T vengono stimolate ed espanse per tre o nove giorni.
Il profilo di differenziazione cellulare come indicato dalla strategia di gating mostrata qui, viene analizzato misurando l'abbondanza di glicoproteine distinte espresse sulla superficie cellulare. Un progressivo spostamento verso la differenziazione dell'effettore si vede nel tempo durante la cultura X-Vivo. Viene quindi valutata la funzione dell'effettore e la capacità proliferativa delle cellule CAR T in risposta all'antigene.
Le celle espanse meno sono funzionalmente superiori a quelle ampiamente coltivate per una durata più lunga. In un modello di topo xenografto umano di ALL viene confrontata la potenza delle cellule CAR T raccolte in diversi periodi di tempo. Le cellule di nove giorni mostrano una risposta anti-tiepida dose-dipendente con una risposta completa del valore di una dose elevata di tre milioni;e una perdita di efficacia per la bassa dose di 500.000.
Tuttavia, il giorno in cui tre cellule hanno mostrato un controllo persistente del tumore sia in dosi alte che basse. Questa risposta è associata al conteggio assoluto di CAR-T 19 nel sangue periferico dei topi. Nel complesso, questi risultati forniscono la prova che le cellule CAR T raccolte in precedenza, superano quelle raccolte in seguito.
Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti ulteriori test di funzione come il saggio di cavalluccio marino per misurare le loro proprietà metaboliche come il consumo di ossigeno o la capacità di spir-it-ed. Diversi cicli di ristimolazione possono anche essere eseguiti per fornire informazioni sulla loro differenziazione e persistenza delle cellule CAR T. Usando questo lavoro come base, noi e altri ricercatori siamo impegnati in studi per abbreviare ulteriormente il processo culturale.
Può anche essere esteso nella progettazione di approcci di base per altri antigeni del cancro. Prestare sempre attenzione quando si lavora con il lentivirus. Ma anche quando il lentivirus è progettato per essere replicante incompetente.
