La fabbricazione di strutture tubolari è un approccio promettente all'ingegneria tissutale delle reti vascolari, che rimane una delle principali sfide nella coltivazione di tessuti spessi in vitro. Il principale vantaggio della tecnica core/shell è la semplice produzione di impalcature a filamento cavo in un unico passaggio, riducendo i tempi di fabbricazione e potenzialmente consentendo la stampa diretta con le celle. Preparare una formulazione idrogel con le proprietà viscoelastiche appropriate e sostenere un flusso continuo bilanciato dei materiali nucleo/guscio è fondamentale per la stampa 3D di impalcature stabili.
Per iniziare, riempire la siringa sterile da 5 ml con idrogel appena preparato. Riempire una seconda siringa da 5 ml, dotata di un ago smussato calibro 27, con soluzione di reticolamento preparata al momento. Assemblare l'ugello nucleo/guscio.
Inserire un ago smussato G27 come componente del nucleo e fissare l'ago utilizzando la vite. L'ago interno dovrebbe sporgere a circa 1 mm dall'ugello esterno del guscio del nucleo. Collegare la siringa con la soluzione di retino all'ago G27 nell'ugello e caricare la siringa in uno dei supporti dell'estrusore di una stampante 3D sterilizzata con etanolo.
Montare la siringa con idrogel nel secondo estrusore e collegarla all'ugello. Utilizzare una serratura Luer per collegare un tubo corto all'ingresso laterale Luer dell'ugello del nucleo/guscio. Regolare manualmente l'allineamento fino a quando l'ugello non tocca la superficie prima di ritrarre l'ugello a una distanza pari al diametro esterno dell'ugello.
Importare il codice g dell'impalcatura generato e premere Riproduci per avviare il processo di stampa. Dopo la stampa, rimuovere con cura il substrato con l'impalcatura stampata e versare la soluzione di retiatura secondaria su tutta l'impalcatura. Incubare l'impalcatura per un minuto a temperatura ambiente.
Per staccare l'impalcatura dal substrato, tirare delicatamente l'impalcatura lateralmente. Se l'impalcatura aderisce fortemente al substrato, inserire un bordo affilato tra entrambi i materiali per separarli. Trasferire l'impalcatura in un contenitore fresco.
I raggi UV sterilizzano entrambi i lati dell'impalcatura per 30 minuti per lato. Quindi posizionare l'impalcatura in un mezzo di coltura cellulare incolore e incubare l'impalcatura a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per almeno 24 ore. Il giorno dopo, raccogli l'huvex da una coltura in vitro con 0,25% di tripside per cinque minuti a 37 gradi Celsius.
Quando le cellule si sono staccate, interrompere la reazione enzimatica con 3 mL di mezzo di coltura cellulare fresco e raccogliere le cellule per centrifugazione. Sospendere il pellet in un mezzo di coltura fresco contenente rosso fenolo e diluire le cellule a una concentrazione di 3,4 volte 10 fino alla quinta endoteliale per concentrazione di millilitro. Caricare le cellule in una siringa sterile da 5 ml dotata di un ago calibro 27 e individuare un punto di ingresso nell'impalcatura.
Allineando l'ago con la sezione dritta del filamento dell'impalcatura, forare con cura l'impalcatura ad angolo basso. Verificare che l'ago si trova all'interno del filamento cavo del canale e deprimere delicatamente lo stantuffo per iniettare circa 1-2 mL di sospensione cellulare nell'impalcatura. Il flusso della sospensione dovrebbe essere visibile attraverso l'impalcatura traslucida.
Quando l'intera impalcatura è stata riempita con sospensione cellulare, immergere l'impalcatura in un mezzo di coltura cellulare fresco e restituire l'impalcatura all'incubatore di coltura cellulare per un massimo di 10 giorni. Per l'imaging vivo/morto alla fine dell'incubazione, sciacquare l'impalcatura con PBS e utilizzare un ago contundente per iniettare con cura soluzione viva / morta nell'impalcatura. Verificare che la soluzione abbia riempito l'intera impalcatura e posizionare l'impalcatura a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Al termine dell'incubazione, sciacquare l'impalcatura con PBS e trasferire con cura l'impalcatura su uno scivolo di vetro. Le cellule tinte possono quindi essere osservate nelle impalcature al microscopio a fluorescenza. In questa sezione trasversale di un'impalcatura appena stampata e post-lavorata, si può osservare un canale cavo chiaramente visibile all'interno del filamento.
Anche dopo 72 ore di incubazione nel mezzo di coltura cellulare a 37 gradi Celsius come dimostrato, il filamento mantiene la struttura cava per tutta la lunghezza dell'impalcatura. Qui, viene mostrato un saggio rappresentativo vivo / morto delle cellule endoteliali dopo 48 ore di coltura all'interno di un'impalcatura. Le cellule vive possono essere identificate dal loro segnale fluorescente verde brillante.
Questa tecnica è alla base della fabbricazione in un solo passaggio di impalcature tubolari cave e può essere aggiornata mediante stampa diretta utilizzando celle incorporate nel bio-inchiostro.
