Questo protocollo è significativo perché consente all'utente di generare un sistema di espressione genomica che può subire splicing alternativo e in questo caso formare RNA circolari che possono essere testate per la loro funzione e associazione di malattie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che aprirà la strada ad altri per utilizzare questo protocollo in biologia molecolare e clonazione quando studiano lo splicing alternativo nella formazione e nella funzione dell'RNA circolare. Il mio consiglio a qualcuno che prova questa tecnica per la prima volta sarebbe quello di ottimizzare le condizioni PCR.
Eseguire gradienti o eseguire touchdown PCR con diverse temperature di ricottura e tempi di estensione. Di solito frammenti più lunghi superiori a sei KB estenderanno un KB per ciclo e diverse temperature di ricottura dovrebbero essere testate per la migliore amplificazione. La dimostrazione di questo metodo è fondamentale perché darà agli utenti una migliore rappresentazione visiva degli aspetti più difficili della procedura, in particolare la generazione di primer.
Per iniziare questa procedura, caricare il browser del genoma UCSC e utilizzarlo per identificare gli elementi ripetitivi necessari per la formazione di RNA circolari e incorporarli nei costrutti. È importante sottolineare che i primer per l'amplificazione devono essere al di fuori degli elementi ripetitivi. Incollare la sequenza di RNA circolare nella ricerca blat umana e selezionare l'organismo giusto.
Invia la sequenza, vai alla visualizzazione del browser e ingrandisci 1,5 timer o, a caso. Quindi, passare il mouse sugli elementi ripetitivi per identificarne il sottotipo in una finestra mobile. Gli elementi Alu sono nella linea del seno.
Utilizzare il pulsante traccia predefinito sotto la finestra per reimpostare il browser se si ottiene un'immagine errata. Per prima cosa vai a vedere, DNA sulla linea superiore del browser del genoma USCS per scaricare la sequenza di DNA mostrata nella finestra. Nell'opzione di formattazione sequenziamento selezionare le opzioni estese maiuscole/minuscole/colore.
Selezionate il caso di default come inferiore e selezionate attiva/disattiva maiuscole/minuscole per NCBI RefSeq. Selezionate sottolineatura e grassetto (Bold) e Corsivo (Italic) per RepeatMasker. Fare clic su Invia.
Ci saranno esoni come lettere maiuscole e introni come lettere minuscole. Controllare i bordi dell'esone/introne. Se il browser mostra il complemento inverso, tornare indietro e selezionare la casella del complemento inverso fino a visualizzare i bordi esone/introne corretti.
Copiare quindi il file con l'orientamento corretto in un documento di elaborazione testi ed evidenziare gli esoni. Selezionate i frammenti da amplificare assicurandoche l'introne non inizi o finisca in una regione ripetitiva poiché i primer in queste regioni non amplificano sequenze specifiche. Per iniziare, usa uno strumento Web per progettare i primer per la clonazione.
Per la sequenza vettoriale, aggiungere il sito di inserimento come ultimo nucleotide e successivamente aggiungere i frammenti. Poiché la numerazione vettoriale non inizia con un dato sito di inserimento, il sito di inserimento nel vettore si trova e la parte downstream viene messa davanti alla sequenza a monte. Regolare i primer se i loro punti di fusione sono distanti più di quattro gradi Celsius e non funzionano nell'amplificazione.
In questo studio, i geni reporter che generano RNA circolari vengono clonati e analizzati. I prodotti PCR ottimizzati sono separati su un gel di agarosio dell'1% contenente gel verde 1X. Le singole bande rappresentano i prodotti PCR che verranno utilizzati nell'assemblaggio del DNA enzimatico.
Queste bande vengono quindi tagliate dal gel e purificate. Il prodotto PCR purificato non è fedele alle dimensioni previste con gel verde, quindi i prodotti sono separati anche su un gel di agarosio all'1% che viene successivamente colorato con bromuro di etidio per garantire che i prodotti siano delle dimensioni corrette. Per iniziare, impostare un kit di assemblaggio enzimatico del DNA.
Combinare il vettore e gli inserti in un rapporto molare da uno a due. Quindi, aggiungere 10 microlitri di mix master di assemblaggio del DNA. Incubare i campioni per 60 minuti a 50 gradi.
Scongelare le cellule competenti sul ghiaccio durante l'incubazione. Le cellule devono essere in un volume di 50 microlitri. Quindi, trasformare le cellule competenti con la reazione totale di assemblaggio.
Aggiungere due microlitri del prodotto assemblato refrigerato alle celle competenti. Mescolare facendo scorrere delicatamente il tubo da quattro a cinque volte. Non vortice.
Mettere la miscela sul ghiaccio per 30 minuti. Scaldare la miscela a 42 gradi Celsius per 30 secondi. Quindi riposizionare sul ghiaccio per due minuti.
Successivamente, aggiungere 950 microlitri di supporti SOC a temperatura ambiente al tubo. Incubare a 37 gradi Celsius per 60 minuti mentre si trema a 300 giri/min. Durante questa incubazione, riscaldare due piastre di selezione che contengono l'antibiotico appropriato.
Dopo l'incubazione, centrifugare il tubo di reazione a 10.000 g per 30 secondi per pellettare le cellule e placcare il 25% delle cellule su una piastra di selezione e il 75% dall'altra. Incubare queste piastre durante la notte a 37 gradi Celsius. Prima di iniziare la trasfezione, controllare il DNA per restrizione digerire.
Qui, un tau minigene rappresentativo che contiene esoni da nove a 12 viene tagliato con enzimi di restrizione indicati per escludere le principali ricombinazioni. Per la trasfezione, sciogliere prima il cloridrato lineare di polietilene in acqua ad una concentrazione di un milligrammo per millilitro a pH due. Utilizzare idrossido di sodio per portare il pH fino a sette e filtrare sterilemente la soluzione con un filtro da 0,22 micrometri.
Conservare la soluzione a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronta per l'uso. Quindi dividere le cellule nei pozzi di una piastra a sei porri e lasciarle crescere durante la notte su supporti DMEM contenenti il 10% fbs. Il giorno dopo, aliquote un microgrammo del gene riportato in un tubo sterile e aggiungere 200 microlitri di cloruro di sodio filtrato sterile da 150 millimolare.
Mescolare con il vortice. Successivamente, aggiungere la soluzione di polietilenimina a questa miscela con un rapporto di tre microlitri di polietilenimina per ogni microgrammo di DNA. Centrifugare brevemente per raccogliere campioni nella parte inferiore del tubo.
Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi aggiungerlo direttamente alle celle HEK293. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Il giorno dopo, usa un kit di isolamento dell'RNA per isolare l'RNA per RT-PCR. cDNA da due campioni derivati da tessuti cerebrali umani sono amplificati con primer circolari di RNA che circondano l'esone 1210 inverso e l'esone circolare 1211 in avanti. Mentre si vede la banda prevista corrispondente all'RNA circolare tau, le altre bande forti sono artefatti che non corrispondevano al genoma umano.
Questo esperimento viene ripetuto con identiche condizioni PCR, ma la trascrizione inversa è stata eseguita solo con il primer inverso circ tau exon 1210. Solo la banda prevista viene amplificata e convalidata tramite sequenziamento. L'RNA viene quindi trattato con RNasi R che rimuove l'RNA lineare.
L'RNA circolare è rilevabile dopo il trattamento mentre l'RNA lineare non fornisce più un segnale rilevabile. L'RNA è isolato 24 ore dopo la trasfezione e analizzato da RT-PCR. L'amplificazione dell'mRNA tau lineare mostra due bande dovute allo splicing alternativo dell'esone 10.
Il loro rapporto cambia con l'espressione over dei fattori di splicing. L'amplificazione dell'RNA tau circolare 1210 mostra la dipendenza dell'espressione dell'RNA tau circ sull'espressione di alcuni fattori di giunzione in particolare la chinasi CLK2 simile alla Cdc2 e la proteina SR 9G8. La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è la progettazione e la posizione dei primer quando si costruisce un minigene.
Il primer non dovrebbe trovarsi in elementi ripetitivi e dovrà essere ottimizzato in condizioni diverse a seconda del frammento amplificato. Seguendo questa procedura, altri metodi che possono essere eseguiti testeranno la funzione degli RNA circolari. Gli utenti possono testare la traduzione o il sequestro delle proteine per identificare una funzione per lo specifico RNA circolare a cui l'utente è interessato.
Questa tecnica ha spianato la strada all'utilizzo di frammenti genomici in un sistema minigene in grado di esprimere es oltre gli RNA circolari consentendo all'utente di testare e identificare la propria funzione e in alcuni aspetti la loro associazione alla malattia. L'implicazione di questa tecnica si estende verso potenziali terapie e diagnostica di una particolare malattia, ad esempio tauopatie, malattie neurodegenerative associate alla patologia tau. Abbiamo scoperto che la proteina tau associata ai microtubuli, nota come MAPT, genera RNA circolari che crediamo contribuiscano alla patologia della malattia e questo metodo ci consente di studiare completamente questi RNA circolari e identificarne la funzione e la relazione con la malattia.
Questo metodo potrebbe fornire informazioni su una migliore comprensione degli RNA circolari, delle loro funzioni e del ruolo che possono svolgere in determinate malattie. Questo metodo può essere applicato nella clonazione di altri minigeni che esprimono RTA circolari tra le specie in cui può fornire informazioni sulla loro funzione. L'amplificazione dei prodotti PCR si rivela la più difficile con lunghi frammenti amplificati dal DNA genomico, insieme ad avere più elementi ripetitivi all'interno del frammento.
