Il rabdomiosarcoma è una rara forma di sarcomi dei tessuti molli caratterizzati istologicamente dalla morfologia dei tessuti e dall'espressione di marcatori miogenici. Tuttavia, data l'esistenza di diversi sottotipi di questi tumori e l'eterogeneità degli stimoli che contribuisce alla sua formazione, l'identificazione della cellula di origine è stata molto impegnativa. Qui descriviamo metodi riproducibili e affidabili per l'identificazione della cellula di origine dei rabdomiosarcomi a partire dai tessuti tumorali appena raccolti dai topi e questo test è il saggio di formazione della tumorsfera.
I principali vantaggi del test di formazione della tumorsfera è che si basa su proprietà cellulari che sono note per essere presenti nelle cellule che originano il tumore e può anche essere utilizzato per l'espansione e l'arricchimento della specifica popolazione cellulare. Inoltre, la sua struttura sferoide imita l'ambiente tumorale, quindi possono essere utilizzati come studi di screening farmacologico. Questo metodo ha il potenziale per essere applicato ad altri tipi di tumori perché non richiede una conoscenza preliminare dei marcatori molecolari, ma può richiedere l'ottimizzazione delle condizioni di coltura.
La tumorsfera può richiedere del tempo per formarsi, specialmente se si cerca di identificare una rara popolazione cellulare all'interno del tumore. Pertanto, non è suggerito di guardare la piastra di sottocultura ogni giorno, poiché potrebbe influire negativamente sui risultati dei tuoi esperimenti. Inizia riscaldando una piastra di 10 centimetri con cinque millilitri di mezzi di isolamento in un'incubatrice a 37 gradi Celsius.
Pesare da 500 a 1.000 milligrammi del tessuto tumorale e posizionare nel piatto. Portare il piatto con il tessuto tumorale in un cappuccio di coltura sterile e tritarlo con una lama di rasoio. Per una digestione ottimale, assicurarsi che le dimensioni dei pezzi tritati siano uniformi.
Trasferire il tessuto tritato e il supporto di isolamento cellulare in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Lavare la piastra con altri quattro millilitri di supporto e aggiungerlo al tubo. Aggiungere 700 unità per millilitro di soluzione di collagenasi al tubo e incubarlo in un bagno d'acqua tremante a 37 gradi Celsius per 1 ora e mezza.
Dopo l'incubazione, far girare il tessuto a 300 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante senza interrompere il pellet, quindi rimescolare il pellet in 10 millilitri di seconda soluzione di digestione e incubare nel bagno d'acqua tremante per altri 30 minuti. Dopo la seconda digestione, pipettare la sospensione cellulare su e giù e passarla attraverso un filtro in nylon da 70 micrometri su un tubo di centrifuga da 50 millilitri.
Quindi lavare il filtro con 10 millilitri di mezzi di isolamento cellulare e far girare il tessuto a 300 volte g per cinque minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in 20 millilitri di mezzi cellulari tumorali. Trasferire la sospensione su una piastra di coltura di 15 centimetri e posizionare le cellule in un incubatore di 37 gradi Celsius durante la notte.
Il giorno dopo, cambia il supporto per rimuovere detriti e cellule morte che potrebbero influenzare negativamente la sopravvivenza delle cellule. A questo punto, valutare la confluenza cellulare e consentire alle cellule di crescere nell'incubatore fino a raggiungere il 90%Monitorare le cellule ogni giorno e cambiare il supporto ogni due giorni. Per la derivazione della tumorsfera, utilizzare le cellule al passaggio P1 o P2 per evitare la selezione cellulare attraverso più passaggi.
Lavare la piastra cellulare con PBS e quindi coprirli con soluzione di distacco. Posizionarli nell'incubatrice per cinque o 10 minuti e quindi confermare il distacco guardando la piastra sotto un microscopio a campo luminoso. Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungere il supporto cellulare tumorale alla piastra e trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga.
Far girare le cellule a 300 volte g per cinque minuti, rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule nei mezzi della tumorsfera. Dopo aver riaspenso le celle, contarle usando Trypan blue e calcolare la concentrazione cellulare. Placcare il numero corretto di cellule in una piastra a basso attacco da 96 po 'e posizionare le cellule nell'incubatrice fino alla fine dell'esperimento, facendo attenzione a non disturbare la piastra a meno che non reintegri il supporto.
Dopo aver completato l'esperimento, identificare manualmente le tumori al microscopio a campo luminoso o utilizzando il software Celigo. Il numero e le dimensioni delle tumorisfere possono essere valutati come risultato di questo saggio. Per preparare le tumorisfere per il trapianto di allografto, riunire tutte le tumorisfere ottenute da uno specifico tipo di cellula o trattamento.
Centrifugare le atmosfere tumorali e rimuovere con cura il supernatante con una pipetta di un millimetro seguita da una pipetta da 200 microlitri, quindi lavarle con 10 millilitri di PBS sterile. Spinte di nuovo giù le atmosfere tumorali e aspirate il PBS. Aggiungere 500 microlitri a un millilitro di soluzione di distacco cellulare sopra il pellet della tumorsfera e incubare le cellule in un bagno d'acqua tremante a 37 gradi Celsius.
Controlla la progressione della digestione ogni 10 minuti. L'intero processo richiedere fino a 30 minuti. Se la digestione della tumorsfera nel bagno d'acqua tremante non è sufficiente per ottenere una soluzione a singola cellula, si suggerisce un'interruzione meccanica attraverso la pipettazione su e giù.
Si noti che dopo aver ruotato le atmosfere tumorali non formano un pellet stabile, quindi aspirare il supernatante deve essere fatto con attenzione con una pipetta da un millilitro e pipette da 200 microlitri. Una volta ottenuta una soluzione a singola cellula, aggiungere un volume di mezzi cellulari tumorali e farlo girare verso il basso a 300 volte g per cinque minuti a 4 gradi Celsius. Dopo questa centrifugazione, tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti sul ghiaccio.
Rimescolare le cellule nei mezzi cellulari tumorali freddi e contare le cellule vive usando l'esclusione blu di Trypan. Determinare il numero corretto di cellule per l'allografto e diluirlo in 50 microlitri di mezzi cellulari tumorali freddi. Posizionare una punta di pipetta in mezzi cellulari tumorali freddi per raffreddarla e quindi usarla per prendere 50 microlitri di soluzione ECM fredda e aggiungerla al tubo con le cellule, assicurandosi di non rimuovere il tubo ECM dal ghiaccio durante questo processo.
Mantenere le cellule sul ghiaccio fino al trapianto e posizionare una siringa per insulina limitata da 0,5 millilitri con un ago calibro 29 sul ghiaccio. Dopo aver confermato che il mouse è stato correttamente anestetizzato, radere il lato destro dell'animale, aspirare la soluzione cellulare nella siringa raffreddata e iniettare le cellule per via sottocutanea nell'area rasata. Se l'iniezione viene eseguita correttamente, sotto la pelle si formerà un urto visibile.
Questo protocollo può essere utilizzato per formare in modo affidabile le cancerosfere per l'identificazione di popolazioni cellulari rare responsabili dello sviluppo del sarcoma dei tessuti molli. Una parte fondamentale di questo saggio è la discriminazione tra le cancerosfere e gli ammassi cellulari, che mostrano chiare differenze morfologiche. Per determinare la concentrazione ottimale alla quale una proteina di interesse innesca un effetto sulle cellule tumorali, è necessario valutare il livello di espressione degli obiettivi a valle della proteina.
Tre dei geni testati hanno mostrato una risposta dose-dipendente al trattamento proteico ricombinante e uno no. Al fine di stabilire un protocollo efficiente, sono stati analizzati gli effetti della trasfezione sulle cellule tumorali intrinseche;sono state testate due diverse quantità di reagente e l'efficienza è stata valutata con un plasmide reporter GFP. Minori quantità di reagente hanno portato a una maggiore efficienza di trasfezione.
È stato necessario attuare un protocollo in due fase per eseguire la trasfezione sulle celle in sospensione. La trasfezione è stata eseguita su cellule aderenti e 24 ore dopo sono state staccate e placcate in sospensione;dopo sette giorni, le tumorisfere controllate esprimevano GFP. Dopo che le tumorisfere sono state ottenute, trattate e trapiantate è possibile confrontare l'effetto di questo diverso trattamento nella crescita tumorale in vivo.
Questi metodi consentiranno agli scienziati di rispondere alle domande ancora in piedi sulla cellula di origine dei rabdomiosarcomi, stabilendo allo stesso tempo le basi per lo screening farmacologico.
