Questo nuovo protocollo di trapianto di midollo osseo può essere utilizzato per indagare come le cellule dendritiche ospiti regolano le risposte di graft-versus-host e graft-versus-leukemia dopo il trapianto. Le rigenerazioni cellulari ex vivo consentono di adattare questo protocollo per testare il ruolo di altre popolazioni di cellule immunitarie come macrofagi e neutrofili semplicemente modificando la condizione di coltura. A dimostrare la procedura con me saranno il direttore di laboratorio Krystal Hossack e il laureato Sanjeev Gurshaney.
Per la preparazione del midollo osseo C57BL/6 impoverito con cellule T del donatore, raccogliere il femore e la tibia secondo protocolli standard da topi donatori eutanasiati e trasferire le ossa in una piastra di Petri di 92 millimetri di diametro contenente mezzo 1%RPMI. Utilizzando le forbici, rimuovere le estremità da ogni osso e riempire una siringa da tre millilitri dotata di un ago calibro 26 con mezzo fresco 1%RPMI. Inserire l'ago in un'estremità di un osso e deprimere lo stantuffo per sciacquare il midollo osseo dalla cavità e in un filtro cellulare di raccolta.
Una volta raccolto tutto il midollo osseo, filtrare i pezzi di midollo osseo attraverso un filtro a rete da 75 micrometri e trasferire la sospensione a cella singola in un nuovo tubo da 50 millilitri. Sedimentare le cellule mediante centrifugazione e resostigliere il pellet a una concentrazione di 20 volte 10 a sei cellule per millilitro in PBS integrata con lo 0,5% di BSA. Successivamente, aggiungere 0,05 microgrammi di anticorpo THI1 per uno per 10 alle sei cellule per un'incubazione di 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte con 10 millilitri di PBS ghiacciato e rimescolare il pellet a una concentrazione di due volte 10 fino alle sette cellule per millilitro nello 0,5% di BSA integrato con il 10% di complemento di coniglio giovane e il 2%DNAse in acqua sterile per un'incubazione di 45 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte con 15 millilitri di PBS fresco per lavaggio e rimorsi il pellet in 20 millilitri di PBS contenenti 0,5%BSA. Mettere in comune i linfonodi e la milza in un colino poro di 40 micrometri e utilizzare uno stantuffo per siringhe per macerare i tessuti attraverso i filtri per rilasciare le cellule.
Lavare il colino e lo stantuffo con mezzo RPMI integrato con 1%FBS per raccogliere tutte le cellule e sedimentare le cellule mediante centrifugazione. Aggiungere cinque millilitri di tampone di lysis ACK al pellet cellulare. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, interrompere la reazione con cinque millilitri di mezzo integrati con 1%FBS e pelletare i globuli bianchi mediante centrifugazione.
Resostigliere il pellet in cinque millilitri di tampone MACS per contare e diluire le cellule a una concentrazione di due volte 10 alle otto cellule per millilitro nel tampone MACS fresco. Aggiungere l'appropriata concentrazione di anticorpi anti-eriotiroide, anti-granulocita, anti-B-cell e anti-NK-cell depletion per uno per 10 alle sei cellule per un'incubazione di 15 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con 10 millilitri di tampone MACS ghiacciato e rimorsi il pellet a una volta per 10 alle otto cellule per concentrazione di millilitro nel tampone MACS fresco.
Successivamente, aggiungere 0,22 microlitri di MicroBead anti-biotina per uno per 10 alle sei cellule con miscelazione per un'incubazione di 15 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le celle con 10 millilitri di tampone MACS ghiacciato e raccogliere le cellule T arricchite non vincolate mediante separazione magnetica delle perline utilizzando il separatore MACSxpress secondo i protocolli standard di isolamento delle perline. Al termine della separazione, sedimentare le cellule T per centrifugazione e rimosogliere il pellet in cinque millilitri di tampone MACS fresco per il conteggio.
Per generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo, isolare il midollo osseo dai femore di tipo selvatico o topi knockout di fattore B come dimostrato e lisciviare i globuli rossi in cinque millilitri di tampone di lisi ACK, fermando la reazione con 10 millilitri di RPMI integrati con 1%FBS dopo cinque minuti. Dopo aver raccolto le cellule intere del sangue per centrifugazione, risosorne il pellet in 10 millilitri di coltura medio a due volte 10 alla sesta temperatura per concentrazione di millilitro e aggiungere 20 nanogrammi per millilitro di GM-CSF alle cellule prima di seminare 10 millilitri di cellule su singoli piatti di Petri da 100 per 15 millimetri a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per sei giorni. Il sesto giorno, attivare le colture cellulari dendritiche derivate dal midollo osseo con 25 microgrammi per millilitro di LPS per piastra.
Almeno l'85% delle cellule del midollo osseo coltivate si differenziano in cellule dendritiche. La purezza delle cellule T dopo l'arricchimento magnetico delle perline è del 90%Il modello C57BL/6 BALB/c non corrispondente all'MHC maggiore corrisponde strettamente allo sviluppo di GVHD dopo il trapianto. Il picco di gravità si verifica circa 11 giorni dopo il trasferimento cellulare seguito da una riduzione dei punteggi clinici e dal recupero del peso corporeo fino al giorno 16.
I destinatari soccombevano uniformemente al GVHD da 30 a 40 giorni dopo il traspianto. È interessante notare che il trapianto con cellule dendritiche knockout di fattore B migliora la sopravvivenza del ricevente e i punteggi clinici GVHD. Il linfoma a cellule B A20 trasdotto in luciferasi consente il monitoraggio della crescita tumorale negli animali vivi.
In questo esperimento rappresentativo, tutti i destinatari selvatici balb/c che hanno ricevuto solo midollo osseo più A20 sono morti per una ricaduta tumorale. I riceventi di tipo selvatico BALB/c trapiantati con cellule T del donatore di origine ACC1 derivate dal midollo osseo sono morti di GVHD. Inoltre, gli animali che hanno ricevuto midollo osseo donatore e cellule T impoverite di ACC1 sono morti sia di GVHD che di ricaduta tumorale.
Per generare abbastanza cellule del midollo osseo, le ossa di tibia e femore raccolte devono essere completamente libere dal tessuto muscolare prima della correzione del midollo osseo. La purificazione negativa delle cellule del midollo osseo con biotinilasi anti-CD3 e Anti-Biotina MicroBeads può anche essere eseguita per esaurire il linfocita dal midollo osseo.
