Il micro-patterning è uno strumento molto potente perché consente di studiare le risposte cellulari per definire segnali biochimici e biofisici che le cellule incontrano negli organismi viventi. A differenza di altri metodi, il descritto è più flessibile per la generazione di modelli. Ad esempio, consente la produzione di gradienti e micro-pattern di più proteine ad alta riproducibilità.
Il nostro gruppo utilizza limap non solo per studiare la ricerca del percorso neuronale, ma anche come altre cellule rispondono a segnali che hanno influenza sulla proliferazione, differenziazione e migrazione cellulare. Il micro-patterning è usato per rispondere a domande fondamentali in biologia cellulare. Le conoscenze acquisite possono essere utilizzate per modificare i dispositivi esistenti in medicina rigenerativa, ad esempio la riparazione dei nervi dopo la lesione del nervo periferico.
Inizia progettando modelli per la creazione di modelli su software di disegno digitale. Selezionare una dimensione dell'immagine di 1.824 pixel di lunghezza e 1.140 pixel di larghezza. Progettare il modello e salvarlo come file TIFF a 8 bit.
Prima di modellare, pulire e attivare la superficie con un detergente al plasma utilizzando una pressione di processo da 1.000 a 1.300 millitorr e una potenza di 29,6 watt per uno o cinque minuti. Utilizzare un piatto con fondo di vetro con dimensioni del pozzo interno di 20 millimetri e spessore del vetro da 0,16 a 0,19 millimetri. Selezionare un piatto a sei o un singolo pozzo, a seconda del numero di condizioni testate.
Tagliare gli stencil PDMS in condizioni sterili per assicurarsi che si adattino bene al fondo interno del vetro. Rimuovere le otturazioni interne del microwell con forcep sterili e attaccare bene gli stencil sul vetro. Preparare una soluzione PLL-PEG da 0,1 milligrammi per millilitro in PBS e aggiungere 20 microlitri a ciascun microwell.
Quindi, incubare il piatto a temperatura ambiente per un'ora. Dopo l'incubazione, rimuovere 15 microlitri del PLL-PEG da ogni pozzo e lavarlo cinque volte con 20 microlitri di PBS senza lasciarlo asciugare. Preparare un microwell per creare un modello di riferimento rimuovendo 18 microlitri di PBS da un singolo pozzo e aggiungendo cinque microlitri di fotoiniziatore, lasciando PBS nei microlitri rimanenti.
Quindi, utilizzare un evidenziatore fluorescente per contrassegnare bene un vetro interno vuoto. Posiziona il pozzo al di sopra dell'obiettivo e regola la messa a fuoco oggettiva fino a quando il logo PRIMO e lo slogan non si prendono cura delle tue cellule"sono a fuoco. Quindi, registrare la posizione Z del piano focale.
Per creare un motivo di riferimento, visualizzare il bordo del microwell con il fotoiniziore utilizzando la luce trasmessa attraverso la fotocamera e scegliere il simbolo ROI dal menu di destra. Selezionare PRIMO per caricare il modello di modello desiderato, che verrà proiettato sul ROI come unità di progettazione. Passare a una regione periferica del microwell, selezionare Blocca e regolare la messa a fuoco nella posizione Z di calibrazione.
Quindi, selezionate Riproduci (Play) per iniziare a creare una serie fotografica del modello di riferimento. Lavare il microwell del modello di riferimento tre volte con 20 microlitri di PBS per rimuovere il fotoiniziore. Quindi, aggiungere 20 microlitri di matrice extracellulare etichettata fluorescentmente, o ECM, soluzione proteica.
Incubare il piatto a temperatura ambiente per 10-20 minuti, assicurandosi di proteggere bene il riferimento dalla luce. Dopo l'incubazione, rimuovere 18 microlitri di soluzione proteica e lavare il pozzo tre volte con 20 microlitri di PBS. Utilizzare un microscopio a epifluorescenza per visualizzare il modello di riferimento.
Regolare la messa a fuoco sui bordi del motivo attraverso il percorso della fotocamera e registrare la posizione Z in base alla messa a fuoco migliore. Questa posizione sarà la messa a fuoco laser ottimale utilizzata per la successiva creazione di modelli. In condizioni sterili, rimuovere 18 microlitri di PBS da tutti i microlitri.
Aggiungere cinque microlitri del fotoinizionte a ciascun pozzo e omogeneizzare pipettando su e giù. Se si modellano più proteine nello stesso microwell, caricare contemporaneamente tutti i set di modelli desiderati. Quindi, selezionare il numero di righe, colonne e dose.
Salvare la configurazione del modello come file nel software. Passare all'area in cui è stato prodotto il modello di riferimento e regolare la messa a fuoco nella posizione Z ottimale. Quindi, selezionate Riproduci (Play) per avviare la photopatterning.
Le unità di progettazione diventano dal rosso al blu al completamento della fotopatterning. Rimuovere il fotoinizio dal microwell lavandoli tre volte con 20 microlitri di PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere 18 microlitri di PBS da ogni microwell e aggiungere 20 microlitri di soluzione proteica ECM.
Incubare il piatto a temperatura ambiente per 20-30 minuti, assicurandosi di proteggerlo dalla luce. Successivamente, rimuovere 15 microlitri della soluzione proteica ECM e lavare i microlitri tre volte utilizzando 20 microlitri di PBS. Per evitare il cross-binding, aggiungere 20 microlitri di PLL-PEG, o BSA, ai microwell e incubare il piatto a temperatura ambiente per un'ora, al buio.
Quindi, rimuovere 15 microlitri dell'agente bloccante e lavare tutti i microlitri tre volte con 20 microlitri di PBS. Rimuovere 18 microlitri di PBS e aggiungere 5 microlitri del fotoiniziore a ciascun microwell, assicurando che il fotoiniziore sia omogeneo su tutta la superficie dei microlitri. Passare al primo microwell e caricare la configurazione del modello salvata in precedenza.
Quindi, selezionate le azioni da modellare per il secondo ciclo di photopatterning, assicurandovi di deselezionare le azioni dal primo round. Dopo la fotopatterning, rimuovere PLPP lavando con PBS. Quindi, incubare per 20 minuti con la seconda soluzione proteica ECM e lavare i microlitri tre volte con 20 microlitri di PBS.
Utilizzare un microscopio a epifluorescenza per visualizzare e visualizzare i motivi stampati. Quando sei pronto a placcare le cellule, aggiungi un millilitro di mezzo con le cellule al pozzo interno del vetro, assicurandoti di coprire tutti i microwell. E metti il piatto della coltura in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi celsius e 5%.
Al fine di garantire che i modelli generati siano una rappresentazione precisa del modello, le misurazioni dell'intensità della fluorescenza sono ottenute lungo le strisce e da una corrispondente regione di sfondo sopra ogni striscia. Si ottengono micro-pattern definiti riproducibili che vanno da 20 a 2 micrometri di larghezza, ma si può osservare un effetto bordo quando la stampa presenta 20 micrometri o più larghi. Concentrazioni proteiche definite si ottengono incubando con concentrazioni variabili di proteine o variando la dose laser utilizzata per scindere il film antiadesivo.
L'intensità del laser è proporzionale al livello in scala di grigi del modello, generando gradienti di illuminazione UV. La misurazione del profilo di intensità della fluorescenza lungo la striscia di gradiente, è lineare nel modello di motivo e nel modello di sfumatura generato. Questo protocollo può essere utilizzato per creare micro-pattern con più proteine nello stesso microwell, come motivi incrociati con strisce orizzontali di fibronectina e strisce verticali di laminina.
Ma è necessario un passaggio di blocco per prevenire il cross-binding delle proteine. I modelli incrociati generati possono essere successivamente utilizzati per saggi cellulari con linee cellulari neuronali, o cellule CAD, o neuroni primari, DRG di ratto. Quando si esegue questo protocollo, gli aspetti più importanti da ricordare sono fare una corretta calibrazione del sistema, non lasciare che i microwell si asciughino durante le molteplici fasi di lavaggio e utilizzare i parametri giusti per l'incubazione e il blocco delle proteine.
L'analisi del comportamento cellulare coinvolge tipicamente la microscopia, come la fluorescenza, il time-lapse, l'AFM. Un'ulteriore caratterizzazione può comprendere altri metodi biochimici, come la profilazione dell'espressione genica.
