Rispetto ad altri metodi, questo protocollo è più facile da scoprire nuovi antagonisti, agonie e modulatori allosterici quantitativamente e qualitativamente senza conoscere la struttura di idro-diluizione e la formazione della proteina bersaglio. Questo protocollo è altamente efficiente, facile da gestire, economico e disponibile in commercio. Combina questo metodo di screening ad alta produttività con l'analisi ITC, i piccoli peptidi funzionali possono essere ottenuti quantitativamente e qualitativamente.
A dimostrare la procedura saranno Ying Zhao e Qiang Wang, studenti laureati del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, preparare una soluzione di FGFR2 nel tampone di rivestimento a una concentrazione di 10 microgrammi per millilitro. Aggiungere un millilitro della soluzione a un piatto di 35 centimetri quadrati e ruotare ripetutamente fino a quando la superficie è completamente bagnata.
Incubare durante la notte a quattro gradi Celsius con tremori. Il giorno successivo, versare la soluzione di rivestimento e aggiungere la soluzione di blocco preparata. Incubare a quattro gradi Celsius per almeno un'ora, quindi scartare la soluzione di blocco e lavare rapidamente il piatto sei volte con TBST assicurandosi che il piatto non si asciughi.
Ricostituire la libreria originale di fago in un millilitro di TBST e aggiungere questo al piatto rivestito. Scuotere delicatamente la piastra su uno shaker a temperatura ambiente per due ore. Dopo questo, scartare il supernatante e lavare il piatto 10 volte con TBST.
Elutare il fago legato aggiungendo un millilitro di 0,2 glicina molare HCL al piatto e dondolando delicatamente a temperatura ambiente per 10 minuti. Trasferire l'eluente in un tubo di microcentrifugo sterilizzato e neutralizzarlo con 100 microlitri di un tris-HCL molare a pH 9.1. In primo luogo, prewarm le piastre LB e IPTG X-Gal preparate a 37 gradi Celsius per almeno un'ora prima dell'uso.
Utilizzando punte di pipetta con cartucce filtranti, preparare 100 microlitri di dieci volte diluizioni dell'eluente in LB. Dopo che la coltura E.coli preparata raggiunge la fase di registro intermedio, erogare 200 microlitri della coltura in tubi di microcentrifugo sterilizzati uno per ogni diluizione eluente. Per avviare l'infezione, aggiungere 50 microlitri di ogni diluizione ai tubi contenenti la coltura di E.coli. Vortice rapidamente e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.
Quindi utilizzare bastoncini di rivestimento per rivestire le piastre LB e IPTG X-GAL con 90 microlitri di questa miscela. Dopo cinque minuti, invertire le piastre e incubarle durante la notte a 37 gradi Celsius. Conta le placche quando appaiono.
Per iniziare, diluire la coltura notturna in 20 millilitri di LB in un pallone Erlenmeyer da 250 millilitri. Aggiungere l'eluente non amplificato e incubare a 37 gradi Celsius con scuotimenti vigorosi per 4-1/2 ore. Quindi, centrifuga la coltura a 12.000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Trasferire il supernatante su un tubo fresco. Centrifugare di nuovo usando le stesse condizioni e scartare il pellet. Trasferire l'80% superiore del supernatante in un tubo fresco e aggiungerlo all'1/6° volume del 20% di polietilene glicole e al cloruro di sodio 2,5 molare.
Lasciare precipitare il fago durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno dopo, centrifuga il fago precipitato a 12.000 volte G e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Scartare nuovamente il supernatante e la centrifuga utilizzando le stesse condizioni.
Utilizzare una pipetta per rimuovere il supernatante residuo. Rimescolare il pellet in un millilitro di TBS e trasferire il supernatante in un tubo di microcentrifugo. Centrifuga a 12.000 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Trasferire il supernatante in un tubo di microcentrifugo fresco e precipitare nuovamente aggiungendo 1/6° volume di glicole polietilene al 20% e cloruro di sodio molare 2,5. Incubare sul ghiaccio per 15-60 minuti. Quindi, centrifuga a 12.000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Scartare nuovamente il supernatante e la centrifuga utilizzando le stesse condizioni. Utilizzare una pipetta per rimuovere il supernatante residuo. Rimescolare il pellet in 200 microlitri di TBS e centrifuga per un minuto in più per rimuovere le impurità.
Quindi trasferire il supernatante su un tubo di microcentrifugo fresco per ottenere l'eluente amplificato. In questo studio, il numero di input di fago viene mantenuto invariato, mentre la concentrazione di rivestimento della proteina FGFR2 viene gradualmente ridotta. I risultati del giacimento del fago suggeriscono che il numero di fagi recuperati aumenta gradualmente e che dopo tre round, c'è un aumento di 65 volte rispetto a quello del primo turno.
Viene quindi condotto un esperimento ITC per misurare l'affinità del piccolo peptide con FGFR2. I risultati indicano che il peptide SP1 ha un'alta affinità verso FGFR2. Questi dati dimostrano l'efficienza del protocollo di screening.
Per indagare l'attività biologica del peptide SP1, viene eseguito un saggio di proliferazione dei fibroblasti utilizzando un kit CCK-8. Balb/C3T3 vengono incubati con il peptide SP1 a diverse concentrazioni. I risultati suggeriscono che il peptide SP1 sopprime la crescita delle cellule.
La contaminazione da fagi di tipo selvatico deve essere evitata in questo caso. Assicurarsi di utilizzare punte di pipetta resistenti agli aerosol. Mentre la crescita ottenendo l'amplificazione del fago.
Questa procedura può anche essere utilizzata nello screening di piccoli peptidi che si legano a carboidrati, cellule di coltura e tessuti. Questi peptidi possono essere ulteriormente amplificati
