All'interno degli organismi multicellulari, i tessuti mostrano ulteriori gradi nel loro orientamento spaziale. Le cellule si allineano e mostrano un intervallo di priorità su grandi distanze nel corso della morfogenesi. Per capire come vengono raggiunte le disposizioni planari dell'epitelia durante lo sviluppo, è fondamentale tracciare gli orientamenti e le dinamiche di crescita delle cellule con elevata fedeltà temporale spaziale in vivo.
Il protocollo descritto è progettato per l'immagine e l'analisi dei comportamenti cellulari a livello globale e locale nell'epidermide pupale di drosophila. Questa metodologia potrebbe fornire approfondimenti su diverse teoria della ricerca, biologia cellulare, morfogenesi e polarità planare e può essere applicata all'analisi di altri tessuti, strutture e modelli. Tutti i passaggi possono essere eseguiti facilmente dopo un po 'di pratica.
Richiedono precisione. La visualizzazione di questo protocollo aiuta a ottenere risultati ottimali in un tempo più breve. La dissezione pupale è complessa.
Per iniziare, usa un pennello inumidito per trasferire pre-pupe bianche in scena in una fiala di plastica fresca e tienile lì per tutto il tempo necessario a 25 gradi Celsius. Quindi, rimuovere ogni pupa dal muro della fiala con l'aiuto di forcep. Incollare il lato ventrale di ogni pupa su uno scivolo di vetro coperto da nastro adesivo a doppia lato.
Toccare delicatamente gli spiracoli della testa e la superficie dorsale della pupa con le punte delle forcep per assicurare l'adesione della custodia pupale al nastro. Iniziare la dissezione al microscopio stereo rimuovendo delicatamente l'opercolo dal puparium con le forcep. Inserire una punta delle forcep in una superficiale tra la custodia pupale e la superficie della pupa attraverso l'apertura opercolare.
Strappare la custodia dalla testa alla coda lateralmente in una o più altalene, evitando di pizzicare la pupa. Ripiega la custodia pupale incrinato ai lati laterali mentre continui a procedere verso l'estremità posteriore. Rimuovere la pupa dalla custodia pupale aperta inserendo con cura le forcep sotto l'animale e tirando delicatamente verso l'alto.
La pupa si attacca alla punta delle forcep. Tenere delicatamente la pupa per il lato ventrale e trasferire la pupa su un piatto con fondo di vetro sopra una piccola goccia di olio di alocarbonio permeabile al gas. Arrotolare un pezzo di carta velina bagnata ai bordi del piatto e coprire il piatto per mantenere l'umidità.
Orientare la pupa sulla goccia d'olio sui piatti con fondo di vetro in base al dominio e al processo da valutare. Per l'imaging dal vivo a lungo termine della prima espansione dei nidi dorsali, la dorsale orienta lateralmente la pupa. Per immaginirne l'espansione tardiva e il rimodellamento dei tessuti, orientare dorsalmente la pupa.
Trasferire il piatto con fondo di vetro contenente le pupe montate allo stadio del microscopio e concentrarsi sulla superficie dell'area addominale utilizzando la luce trasmessa. Per impiegare la ricombinazione mitotica per indurre mosaici genetici nell'epitelio addominale, preparare le femmine vergini che trasportano una flipasi inducibile da shock termico, un sito FRT in una specifica posizione genomica e un marcatore cellulare riconoscibile distale al sito FRT. Preparare maschi mutanti che trasportano un sito FRT nella posizione genomica equivalente.
Attraversare diverse femmine e maschi in una proporzione da tre a uno in una fiala di plastica a 25 gradi Celsius per quattro o cinque giorni. Per generare cloni somatici negli istoblasti, eseguire un trattamento di shock termico nella terza fase larvale instar della progenie della croce immergendo le fiale di plastica contenenti gli animali in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 45 minuti o un'ora. Nel software image J, utilizzare la funzione di proiezione della massima intensità per proteggere le fette dello stack Z acquisite dalla microscopia confocale in 2D.
I nidi hanno una forma caratteristica che li orienta in un sistema di coordinate planare anteriore a sinistra e dorsale verso l'alto. Per ottenere risultati ottimali con questa analisi, l'immagine di input deve essere acquisita con alta risoluzione. Per ottenere valori di orientamento qualitativo sui bordi delle celle locali, fate clic sul menu del plug-in e scegliete l'opzione di distribuzione J di orientamento.
Impostate il sigma della finestra gaussiana su un pixel, la spline cubica sulla sfumatura, la coerenza minima al 20% e l'energia minima all'uno per cento. Utilizzare l'opzione di rilevamento del colore del plug-in. Impostare la tonalità sull'orientamento, la saturazione alla coerenza e la luminosità sull'immagine di input.
Questo colore codifica gli orientamenti dei bordi delle celle rispetto al sistema di coordinate planare impostato. Quindi, nel menu del plug-in, usate l'opzione di misura J di orientamento per quantificare gli orientamenti cellulari e l'allineamento da cella a cella direzionale. Generare piccole regioni adiacenti non sovrapposte di interesse di peso uniforme circa 20 micrometri per 20 micrometri all'interno dell'area occupata dagli istoblasti.
La misura di pressatura calcola l'orientamento locale dominante e la coerenza dalle ROM. In questo studio, la metodologia utilizzata è in grado di generare film ad alta risoluzione delle pupe in via di sviluppo per periodi fino a 48 ore senza significativa sbiancamento fotografico o tossicità fotografica. Esempi di cloni di tipo selvaggio contrassegnati dall'assenza di RFP NLS e le loro macchie gemelle a 26 ore dalla formazione di puparium sono mostrati qui.
I cloni si allungavano lungo i confini segmentali. Cloni gemelli disposti in parallelo o in tandem. La morfologia di un clone di tipo selvatico a 26 ore e 47 ore dopo la formazione del puparium mostra una complessa morfologia dei confini in entrambe le fasi.
Appezzamenti di scatola e baffi per parametri geometrici a 26 ore e 47 ore dopo la formazione di puparium mostrano che l'area media e il perimetro sono aumentati in modo significativo in questa finestra di tempo. L'orientamento del clone è stato sostenuto durante l'espansione e il rimodellamento. I parametri di forma a 26 ore e 47 ore dopo la formazione del puparium indicano la rugosità, la rotondità e la circolarità appena cambiate nei cloni di tipo selvaggio.
Assicurati di non danneggiare la pupa, altrimenti morirà entro poche ore, influenzando l'imaging dal vivo. Questo protocollo non richiede l'100% di un reagente o di uno strumento sartus. Evitare di pizzicarsi durante la sezionatura.
Applicando queste metodologie è possibile generare film ad alta risoluzione per periodi a lungo termine utilizzando diverse tecniche di immaginazione. Focale per fotoni o dischi rotanti. L'analisi clonale può essere utilizzata per esplorare risposte non autonome poiché le cellule casuali facilitano l'identificazione di colloqui incrociati o meccanismi di comunicazione cellulare.
Questi metodi possono essere facilmente adattati per studiare una gamma completa di fenomeni morfogenetici, inclusa la coordinazione dello sviluppo epidermico, muscolare e neuro durante la metamorfosi.
