The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.

La figura 3 mostra una sintesi della procedura sperimentale. 1. Preparazione del tessuto <ol><li> Per determinare le conseguenze di espressione modificata di un gene di interesse, impostare il seguente croce in duplice copia e mantenere a 25 ° C: UAS-transgene (maschi) X GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (femmine vergini) NOTA: Per ottenere il controllo incrociati tessuto UAS-lacZ maschi a GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: femmine GFP. β-galattosidasi genera difetti nel comportamento cellulare nella retina. </li><li> Per migliorare l&#39;efficacia dei transgeni RNAi, croce UAS-RNAi maschi a GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b femmine vergini. NOTA: i difetti occasionali nel comportamento delle cellule in retine esprimono ectopica DCR-2 sono stati osservati (dati non riportati). La vigilanza è consigliata se si utilizza questo metodo. </li><li> Seletto bianco pre-pupe di genotipi appropriati e posto in provette da 1,5 ml microcentrifuga. Se le pupe esprimere DCR-2, selezionare pupe maschio o femmina: espressione di UAS-DCR-2, un inserto sul cromosoma X, è più forte nei maschi. Pupe dovrebbe essere sessuato a 0 hr APF prima pigmentazione caso pupa - gonadi di maschi sono visibili come grossi globi trasparenti ai lati laterali della pupa (circa un terzo del posteriore). </li><li> Incubare microprovette contenenti pupe, in una plastica tip-box pulito a 25 ° C. Per prevenire l&#39;essiccamento del luogo pupe a 10 cm 2 pezzo di tessuto, imbevuto di acqua distillata, nella punta-box. NOTA: se l&#39;umidità nella punta-box diventa troppo alto il caso pupa può diventare molliccia e difficile da sezionare in fasi successive. </li><li> Incubare per momento opportuno. Per catturare i comportamenti cellulari associati con patterning l&#39;occhio, preparare pupe per l&#39;imaging a circa 17 ore APF, 20 hr APF o 24 ore APF. Vedi Rappresentante Risultati per ulteriori discussioni su quando i comportamenti di cellule specifiche sono meglio rispettati. </li><li> Posizionare un pezzo di nastro biadesivo fresco su un piatto dissezione sylgard nero. Posizionare un lato pupa, dorsale in su, con la testa della pupa aderito al nastro biadesivo (Figura 1A) .Try a non aderire toracica e addominale regioni della pupa al nastro biadesivo. Con una pinza con attenzione sollevare e rimuovere il opercolo per esporre la testa pupa. Strappo lungo il lato del caso pupa per esporre l&#39;area intorno a un occhio. </li><li> Rimuovere delicatamente la pupa del nastro adesivo. Se la pupa rimane aderente, applicare una piccola quantità di acqua distillata alla giunzione tra il caso pupa e il nastro di indebolire l&#39;adesione. </li></ol> 2. Montaggio <ol><li> Costruire un piccolo 15 millimetri 2 telaio da carta assorbente e un buco nel middlethat 5,5 mm di diametro (Figura 1B). Immergere in acqua distillata e posto inil centro di un vetrino da microscopio. Usando una siringa da 30 cc, spremere un anello uniforme di vaselina per circondare la cornice di carta assorbente. Assicurarsi che l&#39;anello vaselina è marginalmente superiore alla larghezza della pupa e che il diametro dell&#39;anello è leggermente inferiore alla larghezza di un vetrino. </li><li> Aggiungere una piccola goccia di vaselina direttamente sul vetrino, nel foro punzonato nella carta assorbente (Figura 1C) Accuratamente organizzare la pupa, sul suo lato, sostenuto dal tallone vaselina (Figura 1D). </li><li> Posizionare un coprioggetto sulla parte superiore dell&#39;anello di vaselina in modo che viene a contatto con l&#39;epitelio sopra neuroepitelio occhio (Figura 1D). Comprimere delicatamente la preparazione per sigillare il vetrino contro la vaselina e generare una piccola superficie di contatto piatta tra la regione occhio pupa e il vetrino. </li></ol> 3. imaging di fluorescenza <ol><li> Immagine preparazione pupa con unmicroscopio a fluorescenza. Ogni 7 min cattura sezioni seriali attraverso il dominio apicale neuroepitelio dell&#39;occhio, nella regione delle giunzioni adherens. NOTA: a) sezioni seriali appropriati sono di solito 4-5 per z-stack composto da 0,2 micron z-passi. b) Irregolarità nella topologia dell&#39;epitelio, compresi urti lievi e pieghe, può rendere difficile per acquisire immagini a fuoco di grandi regioni di tessuto. Mentre l&#39;imaging, si può trovare una parte di una zona di interesse per essere a fuoco, e una regione confinante di essere out-of-focus. Tra cui una piccola goccia di acqua distillata tra l&#39;occhio e la pupa coprioggetto può eliminare alcune pieghe del tessuto acuti ma non la topologia caratteristico leggermente irregolare delle prime fasi della pupa morfogenesi dell&#39;occhio. In questi casi sovracampionamento tessuto estendendo la z-stack fino a fuoco fette vengono acquisiti per l&#39;intero settore. c) Acquisizione di sezioni seriali ogni 7 minuti dovrebbe consentire vivo imaging per 3 a 4 ore, senza una significativa reduction nell&#39;intensità di fluorescenza GFP che possono compromettere la qualità dell&#39;immagine. Intervalli di tempo più brevi possono ridurre il tempo totale di imaging. </li><li> Proseguire l&#39;imaging per 3 a 4 ore. Non utilizzare un messa a fuoco automatica e funzione di tempo che è disponibile su molti microscopi a fluorescenza in quanto la crescita pupa e pompaggio del emolinfa sposta la posizione della retina e vigile rifocalizzazione è necessaria ogni 14-21 min. NOTA che l&#39;imaging più di 4 ore può rallentare o stallo morfogenesi dell&#39;occhio. </li><li> Utilizzare software appropriato deconvoluzione per ridurre sfondo e migliorare il contrasto delle immagini della sezione seriale. Per ogni file z-stack, eseguire il seguente in software LAS AF (vedi Tabella dei Materiali): Selezionare il pannello Strumenti, selezionare 3D Deconvoluzione e fare clic su Applica. </li><li> Generare immagini un massimo di proiezione (MP) per ogni file di stack deconvoluto: Selezionare il pannello Strumenti, selezionare Proiezione 3D e fare clic su Applica. NOTA: L&#39;algoritmo Maximum Projection potrebbe non riuscire a generare un uniformely immagine in-focus per il tessuto che è stato sovracampionato. Una tecnica per affilare le regioni out-of-focus è descritto al punto 5.2. </li></ol> 4. Post-Imaging pupa Rescue e fenotipo di verifica <ol><li> Per affrontare se artefatti sono stati introdotti o la pupa danneggiato durante l&#39;imaging, rimuovere con attenzione la pupa del rig immagini: con pinze rimuovere il vetrino e trasferire la pupa di una fiala pulita di cibo. Conservare a temperatura ambiente o 25 ° C fino a quando la mosca adulta emerge. </li><li> Esaminare attentamente il fenotipo dell&#39;occhio adulti e confrontare agli occhi di mosche adulte emergono dalla mosca croce originale. </li></ol> Elaborazione 5. Immagine <ol><li> Automatico Allineamento Immagine: NOTA: Il tessuto vivo Drosophila si sposterà e crescere durante tutto il processo di imaging. Di conseguenza, i centri di immagini riuniti in momenti successivi non possono corrispondere allo stesso punto nel tessuto Drosophila. Inoltre laintero disco retina ruota di circa 30 ° tra ~ 21 e 23 hr APF. Per evidenziare i comportamenti delle singole celle e ridurre le distrazioni causate dalla crescita organismal, allineare ogni deputato image.While questo può essere eseguito manualmente, il software di editing delle immagini qui utilizzato (vedi Tabella dei Materiali) ha algoritmi incorporati che possono accelerare il processo. <ol><li> Dalla scheda File del menu principale, script aperti e selezionare i file di carico in Stack. </li><li> Importare i file immagine MP nel pannello Livelli di carico e selezionare OK. Assicurarsi che il tentativo di allineare automaticamente l&#39;opzione Images non è selezionata. NOTA: Se questa opzione è selezionata, il software può utilizzare un algoritmo di allineamento che distorce i dati di immagine. </li><li> Una volta che tutti i file MP hanno caricato nel riquadro Layers, assicurarsi che tutte le immagini sono in ordine cronologico tale che il punto di tempo prima è in cima alla pila dei livelli. Se i livelli non sono nell&#39;ordine corretto, trascinarli fino a quando non sono ordinatecorrettamente. </li><li> Selezionare Allineamento automatico livelli dalla scheda Modifica del menu principale. Scegli riposizionare e fare clic su OK. </li><li> Se l&#39;algoritmo Auto-Align non orientare i fotogrammi di un punto di riferimento rilevante, apportare piccole modifiche utilizzando lo strumento Sposta. </li></ol></li><li> Affilatura Composite: NOTA: Out-of-focus regioni di un&#39;immagine iniziale MP possono essere affilate da &#39;coltivazione&#39; della corrispondente pila deconvoluto nel software LAS AF. Ritaglio di un file di stack permette di limitare manualmente l&#39;intervallo di un z-stack che viene sottoposta all&#39;algoritmo massima proiezione. <ol><li> Individuare la funzione Ritaglia nel pannello Strumenti (nella scheda Process). Limitare manualmente le fette iniziali e finali tale da colpire solo la cinghia aderenza all&#39;interno della regione inizialmente fuori fuoco. Fare clic su Applica per generare un nuovo file di stack che è ottimizzato per questa regione. </li><li> Generare un nuovo proiezione massima per lo stack ottimizzato a livello locale e l&#39;esportazione come file TIFF. </li><li> In the software di editing delle immagini (vedi Tabella dei Materiali), script aperti (situati nella scheda File del menu principale) e selezionare Carica file in Stack. </li><li> Importare il file immagine MP iniziale e file MP ottimizzato localmente per un particolare punto di tempo nel pannello Livelli di carico e selezionare OK. Assicurarsi che il tentativo di allineare automaticamente l&#39;opzione Images non è selezionata. </li><li> Selezionare entrambi gli strati negli strati riquadro e quindi selezionare Fusione automatica livelli (che si trova nella scheda Modifica del menu principale) per mascherare automaticamente le regioni competenti delle due immagini, ottenendo una uniforme a fuoco campo retinico. Salva questa immagine composita come file TIFF. </li><li> Ripetere i passaggi 5.2.1 tramite 5.2.5 per tutte le immagini non ottimali MP. </li></ol></li><li> Ulteriori Regolazioni: ruotare, ritagliare e regolare i livelli dei Livelli Movie: <ol><li> Con tutti i livelli selezionati, utilizzare lo strumento Trasforma (Modifica&gt; Trasformazione libera) per ruotare le immagini in modo che l&#39;asse dorso-ventrale della retina è allineatoper l&#39;asse y del telaio filmato. </li><li> Se necessario, utilizzare lo strumento Ritaglia per ridurre il campo visivo di una dimensione e forma desiderata. </li><li> Utilizzare la regolazione del livello (di singoli fotogrammi) per contribuire a migliorare il contrasto tra la membrana cellulare e corpo cellulare. </li><li> Per ragioni stilistiche e per sottolineare comportamenti cellulari specifici, introdurre falsi colori per evidenziare i punti di interesse in ogni fotogramma. </li></ol></li><li> Animazione: convertire le immagini in un filmato: <ol><li> Aprire il pannello Animazione dalla scheda di Windows del menu principale. Selezionare Crea fotogrammi dai livelli dal menu che si trova nell&#39;angolo in alto a destra del riquadro Animazione. </li><li> Si noti che gli strati vengono aggiunti al riquadro di animazione in ordine sequenziale a partire dal fondo della pila. Per invertire l&#39;ordine dei fotogrammi, prima selezionare tutti i fotogrammi e selezionare Inverti fotogrammi dal menu del riquadro Animazione. </li><li> Selezionare un tempo di ritardo fotogramma per ciascun fotogramma utilizzando il menu a discesa sotto il pollice telaiochiodo. NOTA: Il ritardo cornice per Film da 1 a 4 presentato in questo articolo è di 0,8 sec. </li><li> Dalla scheda File del menu principale, aperto Esporta e selezionare rendering video. Scegli QuickTime Export in Opzioni file e selezionare un formato video desiderato. Sotto rendering Opzioni impostare Frame Rate di ordinazione, inserire un frame rate di 15, e fare clic su Render. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells.">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).</li><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+adherens+junctions+during+Drosophila+embryonic+epithelial+morphogenesis+revealed+by+a+Dalpha-catenin-GFP+fusion+protein.">Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein.</a> Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li><li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+specification+in+the+developing+Drosophila.+retina.">Cell fate specification in the developing Drosophila. retina.</a> Dev Suppl. , 19 (1993).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila.+retina.">Pattern formation in the Drosophila. retina.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).</li><li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+behavior+in+the+developing.+Drosophila+pupal+retina.">Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina.</a> Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).</li><li>Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+death+zone:+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye.">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+Drosophila+Dicer-1+and+Dicer-2+in+the+siRNA/miRNA+silencing+pathways.">Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways.</a> Cell. 117, 69-81 (2004).</li><li>Zitserman, D., Roegiers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+sensory+organ+precursor+cells+in+intact+Drosophila+pupae.">Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae.</a> J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waves+of+differentiation+in+the+fly+visual+system.">Waves of differentiation in the fly visual system.</a> Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).</li><li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye.">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).</li><li>Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+simulation+of+cellular+patterning+within+the+Drosophila+pupal+eye.">Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina.">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+is+required+for+successive+cell+decisions+in+the+developing+Drosophila+retina.">Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina.</a> Genes Dev. 1099, 1112 (1989).</li><li>Miller, D. T., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+induction+of+patterning+and+programmed+cell+death+in+the+developing+Drosophila+retina.">Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina.</a> Development. 125, 2327-2335 (1998).</li><li>Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+argos+in+regulating+cell+fate+decisions+during+Drosophila+eye+and+wing+vein+development.">The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development.</a> Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathway+of+signals+regulating+effector+and+initiator+caspases+in+the+developing+Drosophila+eye.">A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye.</a> Development. 129, 3269-3278 (2002).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tugging+force+regulates+the+size+of+cell-cell+junctions.">Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).</li><li>Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tension+is+required+for+correct+recruitment+of+adherens+junction+components+and+zonula+occludens+formation.">Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation.</a> Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

La descrizione di wild-type sviluppo (sopra) costituisce la base per il confronto di eventi patterning in RNAi o genotipi iperespressione. Confronti di sviluppo del tessuto vivo hanno un valore inestimabile per determinare con precisione quali comportamenti cellulari sono regolati da una proteina di interesse. Inoltre, e non qui descritte, l&#39;imaging cellulare dal vivo permette di fare descrizioni qualitative e / o quantitative del ruolo di un gene di interesse negli eventi che motivo l&#39;occhio. In 30-32 ore APF m...

Il composto Drosophila occhio è caratterizzato dalla disposizione dei suoi stereotipo ~ 750 ommatidi separati da un reticolo a nido d&#39;ape di cellule pigmentate accessorie 4,5. Queste cellule del pigmento sono modellati da una combinazione coordinata di eventi: i movimenti delle cellule locali, la crescita delle cellule, cambiamenti di forma delle cellule e l&#39;apoptosi. Visualizzazione diretta di questo epitelio permette di studiare i meccanismi molecolari alla base di questi eventi in un contesto tridimensionale fisiologicamente rilevanti e imperturbabile. Diversamente dai precedenti protocolli 6,7, la tecnica qui delineato incorpora un metodo efficace per stabilizzare il movimento del tessuto estraneo che non può essere disaccoppiato dal processo di imaging. Questo metodo migliora studi di comportamento delle cellule in via di sviluppo Drosophila pupa occhio epitelio - un tessuto che cresce, ruota e si sposta nel corso di imaging. Inoltre, il movimento di stabilizzazione technique dedescritto qui sarà utile per studiare le cellule in altri contesti in cui si verifica il movimento estraneo. Per visualizzare i bordi delle celle nel campo della retina Drosophila, linee mosca transgenici sono stati generati che esprimono ubi-DE-caderina: GFP e UAS-α-catenina: GFP sotto il controllo del driver specifico-eye GMR-GAL4 1-3. L&#39;uso di due marcatori di membrana GFP-tag permette la visualizzazione dei bordi delle celle a luce minore intensità. Questo riduce al minimo i danni ai tessuti e photobleaching esposizione ripetuta a lunghezze d&#39;onda ad alta energia, che consente una maggiore frame rate e la durata del filmato. Per migliorare l&#39;efficacia dei transgeni RNAi, UAS-DCR-2 è stato anche inserito in una seconda linea di volo 8. In un terzo aggiornamento da protocolli precedenti, un impianto di imaging semplice che può essere facilmente montato in maggior parte dei laboratori è descritto. Questo apparecchio evita la necessità di avere un dell&#39;imaging r specializzataig generato da &#39;officina&#39; di un&#39;università o di un servizio simile. Questo impianto di imaging è simile a quella utilizzata per immagine altri tessuti pupa 9,10. Presentato qui è un semplice protocollo live-cell imaging che può essere utilizzato per valutare direttamente gli eventi morfogenetici che contribuiscono a patterning occhio da ~ 17-42 ore dopo la formazione puparium (hr APF). In particolare, questo protocollo permette di determinare le conseguenze di modificare l&#39;espressione genica durante lo sviluppo pupa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b</td>
			<td>Available on request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b&#160;</td>
			<td>Available on request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Scotch double stick tape</td>
			<td style="width:124px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Black Sylgard dissection dish</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sylgard</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sylgard (Black)</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLG170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Glass petri dish</td>
			<td style="width:124px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">25 x 75 x 1 mm glass microscope slide</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">22 x 40 mm glass coverslip</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td>48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Whatman 3mm Chromatography Paper</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-713-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Vaseline</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">19-086-291</td>
			<td>Or purchase at local pharmacy.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">30ml syringe</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S7510-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Adobe Photoshop CS5</td>
			<td style="width:124px;">Adobe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Leica TCS SP5 DM microscope</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-imaging of the drosophila pupal eye

Processi di sviluppo inerenti pupa Drosophila possono spostare e distorcere l&#39;epitelio occhio in modo tale da rendere il comportamento delle cellule individuali difficili da rintracciare durante l&#39;imaging cellulare dal vivo. Questi processi comprendono: la rotazione della retina, la crescita cellulare e la circolazione organismal. Inoltre, irregolarità nella topologia dell&#39;epitelio, compresi urti sottili e pieghe spesso introdotti come la pupa è preparato per l&#39;imaging, rendono impegnativo per acquisire immagini in-fuoco di più di qualche ommatidi in un unico piano focale. Il flusso di lavoro delineato qui rimedi questi problemi, consentendo un facile analisi dei processi cellulari durante lo sviluppo di Drosophila pupa occhio. Pupe Opportunamente-messa in scena sono disposti in una piattaforma di imaging che può essere facilmente montato nella maggior parte dei laboratori Ubiquitin-DE-caderina. GFP e GMR-GAL4 -driven UAS-α-catenina: GFP sono utilizzati per visualizzare i bordi delle celle nell&#39;epitelio dell&#39;occhio 1 -3. Dopo deconvoluzione èapplicata alle immagini catturate fluorescenti a più piani focali, immagini massimi proiezione vengono generate per ogni punto di tempo e migliorate utilizzando un software di editing delle immagini. Algoritmi di allineamento vengono utilizzati per stabilizzare rapidamente il movimento superfluo, rendendo il comportamento delle cellule individuali più facile tenere traccia.

Live-imaging dell&#39;occhio pupa è una strategia di successo per osservare comportamenti delle cellule che contribuiscono al patterning del neuroepitelio. Il ruolo di specifiche proteine ​​può essere facilmente valutata esprimendo transgeni che modificano i livelli di proteina durante lo sviluppo degli occhi. Per fare questo GMR-GAL4 è usato per guidare l&#39;espressione del transgene dietro il solco morfogenetica. Questo offre il vantaggio di non perturbare eventi precedenti che stabiliscono il campo o...

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-imaging del<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

9.3K Views.  Wesleyan University. This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Video: Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A lungo termine Imaging in diretta di<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells named wing imaginal discs formed during embryonic development. In the larval stages the imaginal discs grow, increasing its number of cells and forming monolayered epithelial&#160;structures. Inside the pupal case, the imaginal discs bud out and fold into bilayers along a line that becomes the future margin of the wing. During this process, the longitudinal primodia veins originate vein cells on the prospective dorsal and ventral surfaces of the wing. During the pupal stage the stripes of vein cells of each surface communicate in order to generate tight tubes; at the same time, the cross-veins begin their formation.
With the help of appropriate molecular markers, it is possible to identify the major elements composing the wing during its development. For this reason, the ability to accurately detect transcripts or proteins in this structure is critical for studying their abundance and localization related to the development process of the wing.
The procedure described here focuses on manipulating pupal wings, providing detailed instructions on how to dissect the wing during the pupal stage. The dissection of pupal tissue is more difficult to perform than their counterparts in third instar larvae. This is why this approach was developed, to obtain rapid and efficient high quality samples. Details of how to immunostain and mount these wing samples, to allow the visualization of proteins or cell components, are provided in the protocol. With little expertise it is possible to collect 8-10 high quality pupal wings in a short amount of time.

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

The ability to accurately detect transcripts or proteins in Drosophila tissues is critical for studying their abundance and localization related to the development process. Here is the description of a straightforward procedure to dissect pupal wings. These wings can be used as samples in several techniques (immunohistochemistry, PCR assay, etc.).

Un metodo rapido ed efficiente per sezionare Pupal ali della drosofila adatto per Immunodetections o analisi di PCR

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioingegneria dei microrganismi del midollo osseo umano nel mouse e la loro visualizzazione mediante imaging live

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Dissezione della drosofila Pupal Retina per immunoistochimica, analisi occidentale e isolamento del RNA

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging e analisi delle contrazioni muscolari nell'embrione di Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Scongelamento, coltura e Cryopreserving linee di cellule di Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Imaging e analisi dell'orientamento dei tessuti e delle dinamiche di crescita nell'epiteliale della Drosophila in via di sviluppo durante le fasi pupali

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Preparazione dei test di Drosophila Larval e Pupal per l'analisi della divisione cellulare in live, tessuto intatto

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...