L'attivazione delle cellule epiteliali parietali è un fattore chiave nello sviluppo del tessuto cicatriziale nel glomerulo del rene. Utilizzando questo metodo, possiamo studiare i processi cellulari coinvolti in questa attivazione e, si spera, trovare opzioni di trattamento per rallentare o addirittura fermare la progressione della malattia. Il vantaggio principale della nostra tecnica è che usiamo cellule primarie che crescono direttamente dai glomeruli isolati.
Dopo aver liberato i reni, come delineato nel manoscritto testuale, tenere il rene con le forcep chirurgiche e utilizzare un altro paio di forcep per estrarre le capsule renali. Successivamente, posizionare i reni nei pozzi di una piastra di coltura di sei pozzi che contengono ciascuno due millilitri di HBSS e posizionare la piastra di coltura sul ghiaccio. In primo luogo, trasferire i reni in una piastra di Petri di 100 millimetri e utilizzare due bisturi per tritarli in piccoli pezzi che sono approssimativamente da uno a due millimetri.
Mantenere i pezzi di rene tritati bagnati con HBSS. Quindi, posizionare i pezzi di rene sopra un setaccio metallico di 300 micrometri e premere il rene attraverso il setaccio usando lo stantuffo da una siringa da 20 millilitri. Risciacquare ripetutamente il setaccio con HBSS nel mezzo e utilizzare una pipetta sierologica per raccogliere il flusso e trasferirlo in una piastra di Petri pulita.
Usa un bisturi per raschiare tutto ciò che rimane nel fondo del setaccio e trasferirlo all'omogeneato renale raccolto. Risciacquare l'omogeneato renale attraverso un setaccio di 75 e 53 micrometri con HBSS. Quindi, lavare entrambi i setacci con HBSS per rimuovere tutte le strutture più piccole.
Raccogliere le strutture renali e il materiale rimasto nei setacci lavando la superficie superiore di ciascuno con DMEM integrato con siero di vitello fetale al 20% e trasferire il materiale nei pozzi di una micropiatta di attacco sei ben ultra-bassa. Portare la micropiatta di attacco ultra-bassa su un microscopio a luce invertita e utilizzare una pipetta da 20 microliter presa raccogliere singoli glomeruli incapsulati e o decapsulati. Dopo aver catturato un singolo glomerulus nella punta della pipetta, aggiungere un mezzo DMEM fresco senza materiale renale raccolto nella stessa punta della pipetta a un volume di 20 microlitri.
Trasferire il singolo glomerulus con il mezzo DMEM al centro di un pozzo di una piastra di coltura cellulare di 24 po 'e incubare a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per tre ore per consentire l'attacco del glomerulus al centro del pozzo. Dopo l'incubazione, il glomerulus sarà attaccato al centro del pozzo. Aggiungere con cura 500 microlitri di mezzo basale endoteliale integrati con un kit di fattori di crescita e un ulteriore 5%FBS e 1%penicillina e streptomicina ad ogni pozzo.
Cultura il singolo glomeruli a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per sei giorni. Dopo sei giorni di incubazione, utilizzare un microscopio digitale a luce invertita per scattare immagini e analizzare la crescita glomerulare. Utilizzando un software di analisi delle immagini, determinare l'area di superficie della crescita in uscita glomerulare aprendo uno dei file di immagine con una barra di scala.
Disegnare una linea retta sulla barra di scala e fare clic su Analizza, quindi misurare per determinare la distanza in pixel. Per determinare la scala, fate clic su Analizza (Analyze) e imposta scala (Set Scale) e immettete la distanza nota in pixel, la distanza nota e l'unità di lunghezza. Al termine, fare clic su Ok.
Fare clic su Analizza e imposta misure. Quindi, controllare le opzioni per Area ed etichetta di visualizzazione. Al termine, fare clic su Ok.
Quindi, disegna una selezione a mano libera intorno alla crescita glomerulare. Fate clic su Analizza (Analyze) e misura (Measure) per visualizzare una tabella dei risultati, che contiene l'area di superficie della crescita in uscita nella scala determinata in precedenza. in questo studio, le crescita glomerulari delle cellule epiteliali parietali dei glomeruli incapsulati sono isolate dai reni del topo, coltivate e analizzate.
Le immagini rappresentative della microscopia luminosa mostrano le crescita glomerulari in diversi punti temporali durante la coltura dopo che i glomerulus sono isolati dai reni del topo. Al fine di convalidare che le cellule in crescita siano cellule epiteliali parietali, anche i glomeruli decapsulati vengono isolati e coltivati per sei giorni. I glomeruli decapsulati non mostrano alcuna crescita cellulare durante questo periodo di incubazione.
La colorazione immunofluorescente viene quindi eseguita per diversi marcatori cellulari epiteliali parietali, marcatori specifici del sito fotografico e marcatori cellulari endoteliali. I risultati convalidano che le cellule in crescita, infatti, sono cellule epiteliali parietali. I glomeruli associati ai topi knockout CD44 mostrano un numero ridotto di cellule in crescita, così come una superficie ridotta di crescita glomerulare rispetto ai glomeruli isolati dai topi di tipo selvatico.
Ciò suggerisce un ruolo importante per il CD44 nell'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Utilizzando questa tecnica, è anche possibile studiare gli effetti sui farmaci sull'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Questo può essere fatto trattando i glomeruli isolati con il farmaco di tua scelta e per analizzare le differenze nella crescita cellulare e nella migrazione cellulare.
