L'obiettivo principale di questo manoscritto è quello di presentare una procedura di imaging della microscopia TIRF fotonica a base di chip di nuova sviluppo e della microscopia a localizzazione a singola molecola, come dSTORM. Il componente principale qui è il chip fotonico che sono fatti di serie di guida d'onda ottica. La luce all'interno della guida d'onda ottica è guidata in base alla riflessione interna totale.
Parte della luce è presente sulla superficie sotto forma di onde evanescenti. Queste onde evanescenti, decadono esponenzialmente lontano dalla superficie, con una profondità di penetrazione di un paio di centinaia di nanometri. Questo li rende adatti per l'illuminazione TIRF.
L'illuminazione TIRF tramite la guida d'onda ottica è disponibile su un'area estremamente ampia, definita dalla geometria della guida d'onda, ed è quindi ideale per l'imaging ad alta produttività. La differenza fondamentale tra una configurazione TIRF e dSTORM tradizionale rispetto al nostro approccio è che utilizziamo un chip fotonico per illuminare il campione, invece di inviare luce attraverso un obiettivo di imaging. Il nostro approccio separa l'illuminazione e la parte luminosa di raccolta, aprendo nuove possibilità di imaging.
Posizionare il chip nella piastra di Petri di vetro utilizzando una pinzetta per wafer e coprire completamente con una soluzione 1%Hellmanex. Posizionare la piastra di Petri su una piastra calda a 70 gradi per 10 minuti. Mentre sei ancora sulla piastra calda, strofina la superficie con un tampone di tessuto della camera bianca.
Rimuovere il truciolo dalla piastra di Petri. Risciacquare con almeno 100 millilitri di acqua deionata. Risciacquare con almeno 100 millilitri di isopropanolo, facendo attenzione che il solvente non si asciughi sulla superficie per evitare macchie di evaporazione.
Risciacquare con almeno 100 millilitri di acqua deionata. Asciugare il truciolo con una pistola azotati. Preparare un pdms successivo di 150 micrometri ruotandola in una piastra di Petri.
Utilizzare un bisturi per tagliare un telaio di circa 1,5 per 1,5 centimetri dallo strato PDMS. Sollevare il telaio dalla piastra di Petri con una pinzetta. Depositarlo piatto su un chip pulito e lucido.
Il campione è ora pronto per la semina cellulare. Dopo il seeding cellulare, rimuovere il chip dal supporto. Utilizzare una pipetta per rimuovere il liquido in eccesso dall'esterno della camera PDMS.
Rimuovere il fluido corrente dall'interno della camera PDMS con un pipetto aggiungendo circa 60 microlitri pulire pbs contemporaneamente. Sostituire il PBS con 60 microlitri pulire PBS e lasciarlo incubare per un minuto. Ripetere il passaggio precedente, lasciandolo incubare per cinque minuti questa volta.
Rimuovere il PBS e sostituirlo con 60 microlitri della soluzione colorante. Lasciare incubare il campione per circa 15 minuti, proteggendolo dalla luce. Lavare il campione con PBS utilizzando la procedura descritta in precedenza.
Rimuovere il PBS e sostituirlo con 40 microlitri del buffer di imaging contemporaneamente. Posizionare un coverslip sopra, evitando che le bolle d'aria si formino sotto. Premere delicatamente il coperchio contro la camera di imaging per rimuovere eventuali supporti in eccesso.
Utilizzare una pipetta per rimuovere eventuali supporti in eccesso all'esterno del coverslip. Pulire l'area all'esterno del coperchio con un tampone umido ad acqua per evitare cristalli formati da residui di mezzi ad immersione essiccati. Questa versione della configurazione è composta da tre componenti principali.
Il microscopio con il supporto del filtro, la sorgente di luce bianca, la fotocamera e il revolver obiettivo. Lo stadio di accoppiamento, che è uno stadio piezo a tre assi, con un laser accoppiato a fibre e una lente di accoppiamento. Lo stadio del campione, che è uno stadio manuale a un asse, con punta e inclinazione, con un portavuoto.
Sia lo stadio di accoppiamento che quello del campione sono montati su uno stadio motorizzato a due assi per la traduzione del campione. Posizionare il truciolo sul camion sottovuoto, con la sfaccettatura di accoppiamento verso l'obiettivo di accoppiamento. Assicurarsi che il chip sia a circa una lunghezza focale di distanza dall'obiettivo di accoppiamento.
Accendere la pompa per vuoto. Accendere il laser a un milliwatt. Regolare approssimativamente l'altezza del truciolo in modo che il fascio colpisca il bordo di esso.
Spegni il laser. Accendere la sorgente di luce bianca. Scegli un obiettivo a basso ingrandimento, ad esempio un 10x.
Focalizza il microscopio su una guida d'onda. Traduci il microscopio lungo la guida d'onda per vedere se è ben allineato con il percorso ottico. Spostare il microscopio sul bordo dell'accoppiamento.
Accendere il laser a un milliwatt o meno. Traduci il microscopio lungo il bordo di accoppiamento per trovare la luce laser. Mettere a fuoco il fascio sul bordo del truciolo.
Regolare lo stadio di accoppiamento lungo il percorso ottico nella direzione che riduce le dimensioni del punto del raggio laser fino a quando non scompare. Il fascio è ora sopra o sotto la superficie del truciolo. Regolare l'altezza del palco di accoppiamento fino a quando il punto del fascio riappare ed è massimizzato.
Ripetere i due passaggi precedenti fino a quando il laser non forma un punto focalizzato. Spostare il punto concentrato sulla guida d'onda di interesse. Traduci il microscopio a breve distanza dal bordo in modo che il punto del fascio focalizzato non sia più visibile.
Spegni la luce bianca. Regolare il contrasto. Se la guida d'onda sta guidando, la luce diffusa lungo la guida d'onda dovrebbe essere chiaramente visibile.
Regolare l'asse dello stadio di accoppiamento per massimizzare l'intensità della luce diffusa. Spegni il laser. Accendi la luce bianca.
Regolare il contrasto, se necessario. Passare all'area di imaging. Concentrati con l'obiettivo immaginato desiderato.
Spegni la luce bianca. Inserire il filtro a fluorescenza e ruotare la potenza del laser a un milliwatt. Impostare il tempo di esposizione della fotocamera su circa 100 millisecondi.
Regolare il contrasto in base alle esigenze. Assicurarsi che l'accoppiamento sia ancora ottimizzato. Individuare un'area di interesse per l'imaging.
Attivare il ciclo dello stage piezo per eseguire il ciclo medio verso l'esterno dei nodi. Cattura almeno 300 immagini. Carica lo stack di immagini acquisito nelle Fiji usando uno stack virtuale.
Scegliere Pile e Progetto Z dal menu immagine nelle Figi. Calcola l'immagine TIRF scegliendo Tipo di proiezione, Intensità media. Accendere il laser su un milliwatt e impostare il tempo di esposizione della fotocamera su 30 millisecondi.
Regolare il contrasto e la messa a fuoco. Aumentare la potenza del laser fino a quando non si osserva lampeggiare. Ingrandire una piccola area dell'esempio.
Regolare il contrasto. Acquisisci alcune immagini per vedere se i battito di ciglia sono ben separati. Regolare il tempo di esposizione della fotocamera per un lampeggiamento ottimale.
Accendere il ciclo del palco piezo. Registrare una pila di immagini di almeno 30.000 fotogrammi, a seconda della densità lampeggiante. Aprire Fiji e caricare lo stack dSTORM come immagini virtuali.
Regolare il contrasto, se necessario. Utilizzare lo strumento rettangolo per selezionare l'area da ricostruire. Analisi Open Run nel plug-in ThunderSTORM nelle Fiji.
Imposta le impostazioni di base della fotocamera in ThunderSTORM, corrispondenti al tuo dispositivo. I parametri di default rimanenti sono in genere soddisfacenti. Inizia la ricostruzione.
L'elenco di localizzazione fornito dal software di ricostruzione viene filtrato per rimuovere le localizzazioni non specifiche. Se necessario, viene applicata un'ulteriore correzione della deriva. La principale differenza tra l'imaging basato su chip e l'imaging tradizionale è nella strumentazione e nell'acquisizione dei dati.
La qualità delle immagini ricostruite può quindi essere valutata allo stesso modo di un'immagine da un microscopio commerciale a super-risoluzione. Poiché vengono utilizzate guide d'onda multimodale, l'immagine risultante potrebbe tuttavia mostrare eccitazione disomogenea se vengono raccolte troppo poche immagini. Questo è mostrato nel pannello a.
L'aumento della quantità di modelli di eccitazione dovrebbe provocare eccitazione disomogenea, come mostrato nel pannello b. Qui abbiamo immagini di cellule endoteliali sinusoidali epatiche, con membrana plasmatica con etichetta fluorescente. I pannelli a e b sono immagini limitate dalla diffrazione.
Il pannello c mostra un'immagine limitata dalla diffrazione dell'inserto nel pannello b. Il pannello d mostra un'immagine dSTORM della stessa regione. Le cellule endoteliali sinusoidali epatiche hanno fenestration di dimensioni nanometriche nella loro membrana plasmatica, che sono chiaramente visibili nell'immagine a super risoluzione nel pannello d.
Uno dei principali vantaggi dell'imaging a super-risoluzione basato su chip è l'ampio campo visivo che è raggiungibile. Il pannello a mostra un'immagine dSTORM da 500 micron per 500 micron di cellule endoteliali sinusoidali epatiche con microtubulina con etichetta fluorescente. Il pannello b mostra l'inserto magenta dal pannello a, con immagini a diffrazione limitata e super-risoluzione per il confronto.
Il pannello c mostra l'inserto verde dal pannello a. La risoluzione dell'immagine catturata è di 77 nanometri. In questo video, abbiamo eseguito un ampio campo visivo TIRF e dSTORM imaging di cellule endoteliali sinusoidali epatiche utilizzando un chip fotonico per l'illuminazione.
Il nostro metodo è meno complesso, più compatto e più flessibile rispetto al modo convenzionale di eseguire TIRF utilizzando un obiettivo al microscopio di un'apertura numerica predeterminata e di un campo visivo basso. La microscopia a localizzazione, come dSTORM, è una delle diverse tecniche di imaging a super-risoluzione che abbiamo esplorato utilizzando chip fotonico. Ad esempio, la luce può essere confinata molto più strettamente all'interno di un materiale guida d'onda ottica ad alto indice di rifrazione rispetto a quanto sia possibile utilizzando una lente obiettiva di imaging.
Questa proprietà dell'illuminazione del chip ha trovato applicazione nell'aumentare la risoluzione del metodo di microscopia ottica basato sulle fluttuazioni di intensità e della microscopia ad illuminazione strutturata. Inoltre, i chip fotonici offrono anche miniaturizzazione, economicità e una semplice configurazione ottica. Essere una tecnologia integrata lo rende compatibile con altre funzioni ottiche su chip.
Nel complesso, ciò consente di retrofitting in microscopi convenzionali limitati alla diffrazione, consentendo una super-risoluzione a basso costo.
