Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microscopia ottica, ad esempio come scattare immagini a super risoluzione e immagini FRET utilizzando lo stesso microscopio. Il vantaggio principale di questa tecnica è che potremmo combinare tre diversi moduli di imaging in un unico microscopio, riducendo significativamente il costo complessivo. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto l'assemblaggio del percorso di eccitazione è difficile da imparare.
Richiedono una corretta scelta delle parti e un allineamento ottico sensibile. Per iniziare, installare una scheda di acquisizione dati tramite un'interfaccia PCI e utilizzarla per collegare i laser al computer. Controllare i comportamenti di accensione e spegnimento dei laser mediante l'uscita logica transistor-transistor e la loro regolazione della potenza tramite l'uscita analogica di questa scheda.
Preparare quindi un tavolo ottico isolato dalle vibrazioni con specchi e beam splitter, come mostrato qui e descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Combina i raggi laser in una fibra ottica monomodale montando prima una piastra adattatore in fibra in un supporto di traslazione ad asse Z. Quindi, montare una lente acromatica in un piatto di gabbia.
Utilizzare un'asta di estensione per collegare l'adattatore e l'obiettivo per formare una gabbia. Quindi, utilizzare montanti ottici spessi un pollice per montare la gabbia sul tavolo ottico. Allineare il laser da 647 nanometri regolando i componenti per ottenere la massima potenza laser in uscita attraverso la fibra.
Una volta fatto l'allineamento del primo laser, installare temporaneamente un paio di iris e allineare il resto dei laser uno per uno. Controllare l'efficienza di allineamento di ogni laser con un misuratore di potenza. Assicurarsi di lasciare un diaframma davanti alla piastra dell'adattatore per ridurre i riflessi dei laser.
Successivamente, progettare e installare l'obiettivo di ingrandimento come descritto nel protocollo di testo allegato. Al fine di creare l'effetto astigmatismo necessario per estrarre le coordinate z di ogni singola molecola, posizionare una lente 3D con una lunghezza focale di 10 metri nella cassetta e inserirla nel percorso del fascio di emissione. Per ridurre al minimo le vibrazioni durante l'imaging sequenziale dell'epifluorescenza multicolore, utilizzare filtri di emissione posizionati in una ruota filtrante barriera collegata accanto al microscopio.
Per il rilevamento simultaneo multicolore durante gli esperimenti FRET a singola molecola, posizionare un altro filtro impostato in uno splitter di emissione. Per impostare l'imaging limitato dalla diffrazione utilizzando l'epi-eccitazione, regolare innanzitutto l'angolo incidentale del laser di eccitazione in modalità epi nel braccio di illuminazione. Successivamente, disinnestare l'obiettivo 3D e inserire il cubo bypass nello splitter di emissione.
Quindi, inserire l'obiettivo mag per un'illuminazione ampliata. Una volta configurata, scatta immagini multicanale, z-stack e/o time lapsed dell'esempio in base ai risultati desiderati. Per impostare il rilevamento multicolore a singola molecola di molecole immobilizzate in superficie, spostare prima la ruota filtrante in una posizione vuota.
Ciò consentirà ai laser di passare attraverso. Quindi, regola l'angolo incidentale dei laser di eccitazione sull'angolo del tappeto erboso e disinnestare sia le lenti mag che 3D. Successivamente, attivare la modalità a tre canali nello splitter di emissione sostituendo prima il cubo bypass con un cubo di calibrazione che consente a tutta la luce di passare attraverso tutti i canali.
Quindi, accendere la fotocamera sotto DIC e regolare l'apertura dello splitter di emissione fino a quando sullo schermo non compaiono tre canali completamente separati. Ruotare le manopole di controllo di regolazione verticale-orizzontale sullo splitter di emissione e allineare approssimativamente i tre canali. Quindi, spegnere la fotocamera e sostituire il cubo di calibrazione con il cubo triplo.
Posizionare un campione di perline multicanale da 100 nanometri. All'eccitazione a 488 nanometri, le perle multicanale da 100 nanometri emettono diverse lunghezze d'onda della luce, consentendo l'allineamento a tre canali. Quindi, accendi la fotocamera e il laser da 488 nanometri, ingrandisci una delle perline luminose e infine allinea i tre canali ruotando di nuovo le manopole di controllo della regolazione.
Con il campione ora in posizione, utilizzando un laser debole, navigare in un'area con una densità di punti ragionevole e regolare la potenza del laser e il tempo di esposizione per ottenere livelli accettabili di segnale-rumore e fotobleaching. Quindi utilizzare il software di imaging per scattare immagini time-lapse. Per l'imaging a super risoluzione, inizia inserendo l'obiettivo 3D e rimuovi l'obiettivo mag.
Quindi determinare l'angolo accidentale del laser di eccitazione ottimale come angolo di erba. Per trovare l'altezza oggettiva corretta per l'imaging SR, utilizzare l'imaging DIC per trovare il piano intermedio delle cellule. Identificare il piano in base all'altezza alla quale le celle diventano trasparenti.
Una volta determinato il piano focale desiderato, iniziare l'imaging a super-risoluzione. Durante l'imaging, modificare la potenza del laser da 405 nanometri per mantenere una ragionevole densità di punti lampeggianti. Inizia l'imaging senza potenza laser viola.
Contare il numero di punti lampeggianti in un determinato periodo e aumentare la potenza laser viola in modo che il numero di punti lampeggianti sia mantenuto al di sopra di una soglia di conteggio definita dall'utente nel campo visivo. Analizza i dati rilevando i baricentri di ogni punto nei fotogrammi di imaging ed estrae i valori z per ogni punto dalle larghezze X e Y. Crea un'immagine ricostruita e visualizza gli oggetti in 3D.
Questa configurazione al microscopio consente una commutazione flessibile e riproducibile tra diversi metodi di imaging, tra cui l'imaging epifluorescente convenzionale, l'imaging a super-risoluzione basato sul rilevamento di singole molecole e il rilevamento multicolore a singola molecola. Per rivelare dettagli più fini nell'assemblaggio molecolare, la microscopia a super risoluzione combina migliaia di immagini come questa. Queste immagini vengono quindi ricostruite per generare un'immagine finale a super risoluzione.
Le tecniche di super-risoluzione consentono un'alta risoluzione spaziale, fornendo dettagli che non possono essere visti con altre tecniche. Questo è evidenziato nelle due immagini mostrate qui. L'immagine a super risoluzione mostra la stessa RNasi regolatore batterica dell'immagine dell'epifluorescenza, ma consente il rilevamento di singole molecole.
SmFRET è un altro metodo in grado di angstrom alla risoluzione nanometrica. Qui, le molecole di RNA piegate sono state etichettate con un colorante donatore verde e un colorante accettore rosso. Le traiettorie di intensità della fluorescenza possono essere estratte da singole molecole, generando efficienza FRET in funzione del tempo.
Non dimenticare che lavorare con i laser può essere pericoloso e precauzioni come indossare la protezione degli occhi o abbassare i poteri laser dovrebbero sempre essere prese quando si esegue questa procedura.
