L'ibridazione in situ a montaggio intero, WISH, fornisce un'alta risoluzione e un risultato di fondo basso rispetto ai metodi tradizionali. Inoltre, le piastre a U-slide migliorano la messa a fuoco alla stessa lunghezza focale utilizzando meno WISH può essere applicato su embrioni di topo, embrioni di Drosophila e altri tessuti difficili da maneggiare. Il saggio di formazione del tubo può essere applicato alle cellule androgene differenziate delle cellule staminali.
WISH rende facile comprendere il significato funzionale della correzione della mutazione. La persona che dimostrerà la procedura è Yong Wang, un assistente di ricerca del mio laboratorio. Lavorando al microscopio, utilizzare il sistema FemtoJet per iniettare due nanogrammi di morfolinos e 500 picogrammi di MRNA in embrioni a una cellula.
Pratica la microiniezione di Morpholinos molte volte fino a quando non puoi iniettarla nelle cellule con successo e mantenere l'integrità delle uova. Incubare gli zigoti fino a quando non vengono dechorionati e raggiungere lo stato di sviluppo che corrisponde all'esperimento previsto. Come descritto nella tabella uno del manoscritto.
Quindi, utilizzare una pipetta di plastica per trasferire da 20 a 40 embrioni in un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere un millilitro di soluzione 4%PFA preparata al momento a temperatura ambiente. Dopo aver riparato, lavato e disidratato gli embrioni come descritto nel manoscritto, mettere gli embrioni in un setaccio con rete di nylon sul fondo.
Idratare gli embrioni lavandoli in sequenza nel 75%50% e nel 25% di metanolo per cinque minuti ciascuno. Dopo aver lavato gli embrioni con PBST, aggiungere 50 microlitri di proteinasi K nel tubo con gli embrioni. Dopo la digestione, rimuovere la proteinasi K e lavare gli embrioni con PBST tre volte per cinque minuti ogni volta.
Aggiungere da 50 a 100 microlitri di sonde bersaglio miste in ogni tubo con gli embrioni. Incubare gli embrioni durante la notte a 40 gradi Celsius. Dopo aver lavato gli embrioni come descritto nel manoscritto, utilizzare il 4% di paraformaldeide per fissare gli embrioni per 30 minuti a temperatura ambiente.
Quindi lavare gli embrioni in soluzione SSCT 2x tre volte per 15 minuti ogni volta a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione SSCT e sostituirla con 50 microlitri di Amp 1. Quindi incubare gli embrioni a 40 gradi Celsius.
Dopo 30 minuti, lavare gli embrioni in soluzione 2x SSCT tre volte per 15 minuti ogni volta a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione SSCT e aggiungere 50 microlitri di Amp 2. Dopo aver incubato per 15 minuti e lavato l'embrione come fatto in precedenza, aggiungere 50 microlitri di Amp 3 e toccare delicatamente il tubo.
Incubare gli embrioni a 40 gradi Celsius. Dopo 30 minuti lavare gli embrioni come descritto in precedenza. Quindi aggiungere 50 microlitri di Amp 4 dropwise e toccare con cura il tubo.
Quindi incubare gli embrioni a 40 gradi Celsius per 15 minuti e lavarli tre volte con SSCT. Dopo aver preparato gli embrioni per l'imaging come descritto nel manoscritto, utilizzare un kit di substrato perossidasi DAB per macchiare il campione. Aggiungere 50 microlitri ciascuno dei reagenti di colore A, B e C a un millilitro di acqua distillata.
E mescolare bene per ottenere un fluido di lavoro DAB completo. Aggiungere il fluido al campione e coprire per dieci minuti. Dopo aver accuratamente lavato i campioni, utilizzare un microscopio ottico per immaginirli.
Per iniziare la coltivazione e il controllo degli IPSC HHT, aggiungere la matrice della membrana basale a sei piastre di coltura cellulare del pozzo per coprire il fondo dei pozzi. Incubare le piastre per un'ora a 37 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere la soluzione a matrice di membrana basale utilizzata dai pozzi e aggiungere due millilitri di mezzo mTeSR 1 in ogni pozzo.
Quindi placcare gli IPSC raccolti dall'ultimo passaggio a circa una volta dieci alle sei cellule per pozzo. Dopo aver coltivato gli iPSC per circa quattro giorni, scambiare il mezzo di coltura cellulare con mezzo BEL integrato. Far crescere le cellule per tre giorni per generare cellule mesodermiche.
Per espandere le cellule endoteliali vascolari, sostituire il mezzo con mezzo BEL integrato per quattro giorni. E poi trattare le cellule con lo stesso mezzo e coltura per altri tre o quattro giorni. Purificare le cellule endoteliali vascolari mature utilizzando CD31 Dynabeads secondo le istruzioni del kit.
Quindi raccogliere le celle positive CD31 tramite buffer di eluizione. Mantenere ed espandere le cellule endoteliali purificate nel mezzo EC-SFM contenente VEGF165, bFGF e FBS. Per placcare le cellule endoteliali, iniziare aggiungendo 10 microlitri di matrice di membrana basale per pozzo alle piastre di angiogenesi.
Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Raccogliere le cellule endoteliali e rimostrarle in mezzo di crescita endoteliale 2 pipettando ripetutamente. Aggiungere 50 microlitri di questa sospensione cellulare alla matrice solidificata in ogni pozzo e quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius.
Dopo tre o cinque ore di incubazione, utilizzare un microscopio ad alta risoluzione per valutare la formazione di tubi endoteliali. Acquisire immagini di almeno dieci aree per ogni gruppo. Ispezionare la lunghezza complessiva del tubo, il numero del tubo e i punti di diramazione.
CISH e WISH sono stati eseguiti per determinare l'espressione dell'endoglina in embrioni post-fecondazione 24 ore su 24. Un marcatore endoteliale emogenico e un marcatore progenitore endoteliale sono stati usati per esaminare l'effetto del silenziamento dell'endoglina. Le frecce rosse indicano regioni in cui l'espressione di questi marcatori, aplnrna e npr1a, è diminuita significativamente.
Il test di formazione del tubo endoteliale è stato eseguito sul mutante endoglino e controlla le cellule endoteliali derivate dall'iPSC. La formazione del tubo è stata valutata e fotografata dopo tre ore. La lunghezza del tubo, il numero del tubo e la ramificazione sono stati quantificati utilizzando il software ImageJ.
Le cellule endoteliali mutanti formavano meno rami del controllo delle cellule endoteliali. E i rami nelle cellule endoteliali mutanti aumentarono significativamente dopo la stimolazione con fattore di crescita endoteliale vascolare. Questo metodo può essere utilizzato anche per la generazione di iPS dal sangue periferico.
E con il metodo chiarisce il ruolo del endocrino nella formazione vascolare in vitro e in vivo. Sapendo che correggere la mutazione può fare la differenza nell'angiogenesi, è possibile trapiantare le cellule di nuovo nei pazienti per una potenziale terapia con cellule staminali.
