Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte a livello globale. I modelli di topo sono strumenti utili per studiare questa malattia e il nostro protocollo può essere utilizzato per quantificare l'aterosclerosi nei topi. Utilizzando questo protocollo, le dimensioni della lesione possono essere misurate in tre posizioni vascolari.
La radice aortica, l'arco aortico e l'arteria brachiocefalica. La quantificazione dell'aterosclerosi nei topi può essere un compito noioso. Abbiamo fornito passaggi dettagliati che speriamo possano accelerare il processo.
Alcuni di questi passaggi sono difficili da descrivere per iscritto. Speriamo che questo video ti aiuti a ottenere una solida analisi delle dimensioni della lesione aterosclerotica. Dopo aver raccolto un cuore di topo secondo i protocolli standard, posizionare il cuore su un letto di sughero, il lato ventrale sotto un microscopio sezionante e utilizzare un ago per fissare il cuore al sughero attraverso l'apice.
Tenendo la base del cuore con forcep anatomiche, usa un bisturi tenuto con un angolo di 20 gradi caudally nel piano sagittale e 20 gradi cranicamente nel piano trasversale, per tagliare via i due terzi apicali del cuore. Incorporare la radice aortica e la base del cuore in un composto ottimale della temperatura di taglio, o OCT, e spremere delicatamente il cuore con le flessorie per riempire la radice aortica con composto e rimuovere eventuali bolle d'aria. Trasferire il campione sul fondo di un criomold riempito con OCT con la radice aortica perpendicolare alla superficie inferiore e congelare il composto sul ghiaccio secco.
Quindi conservare il campione di tessuto in un sacchetto congelatore a meno 80 gradi Celsius fino alla criosezione. Per preparare un letto di ancoratura per l'analisi del viso, piegare un segmento di pellicola di cera di paraffina otto volte per creare una superficie piatta di 25 per 25 mm e avvolgere il nastro isolante elettrico nero intorno al film per creare uno sfondo scuro per l'aorta. Posizionare un'etichetta sul lato posteriore del letto di ancorazione e utilizzare una matita di piombo per registrare il numero di identificazione del mouse.
Trasferire l'arco aortico sul letto di ancorazione e aggiungere una goccia di PBS al tessuto. Utilizzando un microscopio stereo, pulire l'aorta dal tessuto adiposo periadventitiale rimanente e utilizzare le forbici Vannas e le forcelle Dumont per rimuovere delicatamente tutto il tessuto adiposo circostante senza manipolare o danneggiare l'aorta. Successivamente, introdurre le forbici Vannas nel lume aortico per esporre la superficie intimale.
Inizia a tagliare la curvatura esterna dell'arco ascendente in direzione distale, continuando ad aprire i rami, compresa l'arteria brachiocefalica e risparmiando la parte dorsale della regione toracica discendente. Per visualizzare la superficie intimale, aprite la curvatura minore e aprite l'aorta. Utilizzando un supporto per aghi micro Castroviejo, fissare l'arco aperto al letto di ancoraggio con l'estremità smussata dei perni degli insetti minuten senza allungare il campione, piegando delicatamente i perni lontano dal campione mentre il tessuto è tenuto in posizione.
Quindi conservare l'arco appuntato a faccia in giù in una piastra di Petri di PBS a quattro gradi Celsius. Per la colorazione Sudan IV, sciacquare l'esemplare per cinque minuti in una piastra di Petri di 70%etanolo con l'arco rivolto verso il basso, prima di trasferire il campione in una soluzione di lavoro Sudan IV per sette minuti. Al termine dell'incubazione, sciacquare il campione con due lavaggi di tre minuti in 80%etanolo per de-macchiare la normale superficie intimale, seguito da un risciacquo finale in PBS prima di riportare il tessuto alla sua piastra di Petri originale.
Quindi acquisire micrografie al microscopio stereo collegate a una fotocamera digitale con ingrandimento 10X, ottenendo immagini dell'arco appuntato immerso in PBS, utilizzando piccoli pesi metallici per tenere il letto di appuntatura sul fondo della piastra di Petri. Per ottenere criosezioni della radice aortica incorporata, impostare la temperatura del criostato a meno 20 gradi Celsius e lo spessore della sezione a 10 micrometri. Montare il blocco OCT contenente la radice aortica sul supporto del campione con il tessuto ventricolare rivolto verso l'esterno.
Se necessario, fissare il posizionamento con uno Strumento di personalizzazione di Office aggiuntivo. La radice aortica dovrebbe ora essere posizionata perpendicolarmente alla lama del coltello. Raccogliere le sezioni di controllo iniziali contenenti il tessuto muscolare cardiaco su normali vetrini al microscopio, controllando la progressione attraverso il tessuto ogni 200 micrometri al microscopio leggero.
Quando appare la prima cuspide aortica, inclinare il campione verso la cuspide zero del punto per allineare il piano di sezione con le altre due cuspidi e contare ogni sezione di 10 micrometri tagliata dal punto zero in poi. Iniziare a raccogliere sezioni per l'analisi da 90 micrometri e in poi secondo lo scivolo previsto, fino a raggiungere gli 800 micrometri dal punto zero. Il calcolo della frazione di lesione dell'area totale del vaso della radice aortica rende i dati meno sensibili alle possibili differenze di angolo durante il sezionamento.
Inoltre, potrebbe essere indicativo calcolare l'area sotto la curva o la dimensione della lesione dell'ateroto per mouse e presentare i dati in un grafico a punti per visualizzare ulteriormente le singole variazioni all'interno dei gruppi. L'accumulo lipidico lesionale può essere quantificato mediante soglia di colore rosso olio O aree positive dell'area di lesione totale. Le arterie coronarie destra e sinistra di solito divergono dall'aorta a circa 250 micrometri dal seno aortico che spesso coincide con le dimensioni della lesione più prominenti.
La rimozione dello sfondo scuro nelle immagini rappresentative degli archi aortici en face può migliorare la visualizzazione visiva. La dimensione della lesione è in genere normalmente distribuita all'interno dei gruppi, consentendo l'analisi statistica utilizzando il test t di Student tra gruppi. Ti consigliamo di esercitarti con del materiale di prova fino a quando non avrai ottenuto competenze sufficienti per l'elaborazione dei tuoi campioni sperimentali.
Se la dimensione della lesione è diversa tra i gruppi, è necessario determinare il meccanismo, poiché un'analisi della composizione della lesione è in genere il passaggio successivo da perseguire.
