Utilizzando il nostro protocollo, la multistrato delle diluizioni bioink liquide non solo promuove una dispersione omogenea delle cellule incapsulate, ma mantiene anche un ambiente bioink adatto alle cellule. Utilizziamo la tensione interfacciale per fermare la sedimentazione delle cellule incapsulate all'interno del serbatoio del bioink, evitando l'elevato carico di sollecitazione di taglio alle cellule durante la stampa di estrusione. Utilizzando questa tecnologia, possiamo generare costrutti di tessuti 3D con una distribuzione cellulare omogenea, fornendo uno stampo funzionale in vitro per tessuti da utilizzare negli studi di medicina di screening e rigenerazione dei farmaci.
Quando si prepara il bioink, è importante prestare attenzione alla temperatura sperimentale e alla procedura di caricamento dell'hygrogel, poiché questi fattori possono influire sulla qualità dell'inchiostro. Prima di iniziare la preparazione, utilizzare unità filtranti per siringhe da 0,22 micrometri per sterilizzare tutti i materiali e sciogliere la gelatina a una concentrazione finale del 10% in PBS a 50 gradi Celsius in un armadietto di sicurezza biologico. Aggiungere l'anidride metacrilica alla soluzione di gelatina con un rapporto di peso di 0,6 a uno con agitazione lenta per almeno un'ora a 50 gradi Celsius.
Alla fine dell'incubazione, trasferire la soluzione mista in un tubo sterile da 50 millilitri e separare la soluzione in strati mediante centrifugazione. Raccogliere lo strato superiore gelMA e diluire la soluzione raccolta con due volumi di acqua deionizzata da 40 a 50 gradi Celsius. Dializzare la soluzione GelMA con una membrana di dialisi di taglio del peso molecolare da 12 a 14 kilodalton contro l'acqua deionizzata per cinque-sette giorni a 40-50 gradi Celsius, cambiando l'acqua due volte al giorno.
Alla fine della dialisi, congelare la soluzione GelMA a meno 80 gradi Celsius durante la notte. Successivamente liofilizzare la soluzione GelMA per tre o cinque giorni in un essiccatore a congelamento a meno 45 gradi Celsius e 0,2 millibar di pressione. Quindi sciogliere il GelMA liofilizzato in PBS integrato con siero bovino fetale al 10%, HEPES 25 millimolare e fotoiniziatore allo 0,5%.
Per ottenere i bioinchiostri GelMA fibroina di seta, mescolare la soluzione GelMA con diversi volumi di soluzione iniziale di fibroina di seta e diversi volumi di PBS come suggerito nella tabella. Quando tutti i bioinchiostri sono stati preparati, sonicare la soluzione per 10-20 minuti. Mentre gli inchiostri sono sonicanti, raccogliere le cellule da una coltura cellulare NIH/3T3 confluente all'80% in un tubo conico da 15 millilitri per soluzione di bioink e pelletare le cellule mediante centrifugazione.
Quindi aspirare con cura i supernaganti e rimodulare le cellule in ogni tubo con due millilitri di bioilnk a una volta per 10 alle sei cellule per millilitro di concentrazione di soluzione di bioink. Per caricare il bioink per la stampa, aggiungere aspirati 400 microlitri di fibroina di seta carica di cellule 0,5 GelMA allo strato inferiore di una siringa da due millilitri. Mettere la siringa in un bagno d'acqua ghiacciata a zero gradi Celsius per cinque minuti per trasformare il bioink dello strato inferiore in uno stato gel prima di caricare 400 microlitri di fibroina di seta carica di cellule 0,75 Bioink GelMA sullo strato di fibroina di seta 0,5 GelMA.
Quindi riportare la siringa al bagno di ghiaccio per cinque minuti, continuando ad aggiungere ogni concentrazione aggiuntiva di bioink carico di cellule alla siringa nello stesso modo. Quando è stato raggiunto un sistema di bioink multistrato con diverse concentrazioni di fibroina di seta all'interno dei diversi strati, surriscaldare il bioink in un incubatore di 37 gradi Celsius per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, caricare un ugello di stampa calibro 27 sulla siringa e impostare la velocità di flusso su 50 microlitri al minuto, la velocità di movimento dell'ugello a due millilitri al secondo e l'altezza dell'ugello a un millimetro.
Successivamente stampare il costrutto di tessuto in modo estrusivo utilizzando un biostampatore su misura a temperatura ambiente e collegare il costrutto di tessuto biostampato con 365 nanometri di luce ultravioletta per 40 secondi a 800 milliwatt. Quindi coltura il costrutto di tessuto retitico in DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% e 1%penicillina-streptomicina in un incubatore di coltura cellulare, cambiando il mezzo ogni otto ore durante i primi due giorni e ogni due o tre giorni dopo. In questa analisi rappresentativa, man mano che la procedura di biostamgrafia progrediva, la densità delle cellule nei pozzi bersaglio è diminuita in tutti i gruppi.
Nel gruppo GelMA zero fibroina di seta, circa il 70% delle cellule sono state depositate nello strato inferiore. Nella fibroina di seta un gruppo GelMA, circa il 40% delle cellule sono state depositate nello strato inferiore e circa il 5% delle cellule sono state depositate nello strato superiore. Nel gruppo GelMA multistrato di fibroina di seta, la deposizione di cellule incapsulate era più omogenea di quella dei gruppi di controllo.
La parte più critica di questo protocollo è il caricamento dei multistrati bioink SF-GelMA. Questo protocollo può essere applicato ad altre analisi di biostamce di estrusione che utilizzano bioinchiostri liquidi.
