La coltura di organi renali e gli organelli derivati da cellule staminali programmate forniscono modi eccellenti per studiare i meccanismi alla base dello sviluppo renale e delle malattie. Tuttavia, l'attuale sistema di coltura degli organi non fornisce flusso sanguigno al rene. A causa di ciò, la ragione per cui i modelli attuali sono incompleti e non riescono a ricapitolare la funzione principale del rene, che è la filtrazione del sangue.
In questa pubblicazione, presentiamo un protocollo migliorato per la coltivazione e la visualizzazione di reni embrionali e organoidi sulla membrana corioallantoica dell'embrione di pollo. Nel nostro nuovo set sperimentale, sovrapporiamo i rudimenti renali trapiantati su CAM con serbatoi di significato permeabili che sono pieni di terreno di coltura. Questo protocollo aumenta significativamente la sopravvivenza dei rudimenti renali e anche delle cellule endoteliali intrinseche.
Il metodo consente il flusso sanguigno al glomerulus in via di sviluppo. Recentemente abbiamo anche pubblicato un nuovo metodo di coltura di organi a direzione fissa che offre immagini time-lapse 3D confocali ad alta risoluzione. Il metodo ha fornito condizioni ottimali per l'imaging confocale a lungo termine degli organoidi e dei rudimenti degli organi.
Nell'approccio, comprimiamo delicatamente il tessuto tra uno scivolo di copertura in vetro e una membrana permeabile. Qui mostriamo come vengono realizzate le lastre progettate su misura e come vengono impostati gli esperimenti di coltura. Così, in questa pubblicazione presentiamo una migliore tecnica di coltura del tubo di organelli renali.
Questo metodo offre un modo migliore per modellare la genesi degli organelli e condurre immagini ad alta risoluzione per studiare reni embrionali e organoidi renali ex vivo. A seconda dell'esperimento, prendere contro-inserti di celle di trasferimento progettati per piastre a sei o 12 pozzi. Tagliare i lati dell'inserto utilizzando uno strumento Dremel per creare un anello di plastica alto due millimetri con una membrana permeabile attaccata ad esso.
Lucidare i bordi dell'anello dal swarf con un bisturi o un coltello affilato. Sterilizzare i mini serbatoi in etanolo al 70% per almeno un'ora. Quindi lavare i mini serbatoi in autoclave con acqua distillata e asciugarli in un cappuccio laminare.
Risciacquare i mini serbatoi in PBS e mezzo di coltura. Posizionare il serbatoio su una piastra di Petri sopra la nostra goccia di mezzo di coltura con la membrana rivolta verso l'alto. Disporre reni embrionali ex vivo sezionati o organoidi renali sulla membrana.
Evitare di lasciare molto liquido intorno ai campioni e lasciarli attaccati da due a 24 ore in un incubatore di coltura cellulare. Il trapianto exenale viene eseguito sulla membrana corioallantoica del pollo embrionale ex ovo di otto giorni. Trasferire i mini serbatoi in modo che la membrana copra l'innesto.
Posizionarli nella periferia del CAM in modo che non coprano l'embrione. Quindi aggiungere il mezzo di coltura ai mini serbatoi. Coltivare i campioni su pollo CAM per nove giorni al massimo.
Sostituire quotidianamente il mezzo di coltura nei mini serbatoi. La vascolarizzazione dei campioni può essere osservata già da 24 a 48 ore dopo il trapianto. Realizzare le piastre a sei pozzi progettate su misura per la coltura fissa.
È necessario iniziare forando fori di 20 millimetri nella parte inferiore della piastra utilizzando una foratrice con una punta di perforazione adatta. Quindi, lucidare i bordi dei fori sul lato superiore della piastra. Infine, sterilizzare le piastre in 70%etanolo per almeno un'ora.
Quindi lavare i piatti in autoclave con acqua distillata e asciugarli in cappuccio lemiare. Lavare il coperchio di 22x22 millimetri scivola in etanolo al 70% e lasciarli asciugare completamente. Incollare il coperchio scivolare sopra un foro nella parte inferiore di un pozzo usando colla tissutale.
Dopo l'asciugatura, ispezionare le piastre al microscopio sterile e rimuovere la colla in eccesso. In primo luogo, mescolare un'aliquota di perline di polistirolo con un volume uguale di idrogeno. Posizionare l'inserto di transcompilato sotto un microscopio sezionante con membrana rivolta verso l'alto e disporre i reni sulla membrana.
Aggiungere una goccia di miscela di perline idro-gel accanto ai reni con attenzione. Capovolgere l'inserto di transcompilato in modo che la membrana e i reni siano rivolti verso il basso. Quindi posizionare con cura l'inserto nel nostro pozzo di piastra a sei pozzi progettata su misura.
Spingere l'inserto molto delicatamente nel pozzo. Seguire il grado di appiattimento dal microscopio fino a quando il rene è a livello con le perline. Tenere l'inserto leggermente premuto al pozzo con una mano e fissarlo alla piastra sciogliendo la plastica in tre punti alla periferia dell'inserto con un ferro da saldare.
Aggiungere due mezzi di coltura millilitro nel pozzo attraverso un'apertura sul lato. Quando si avvia un'immagine time-lapse, trasferire la piastra nell'incubatore sul palco di un microscopio invertito. Il nostro protocollo di cattura CAM modificato consente una vascolarizzazione altamente efficiente degli organoidi renali e dei reni embrionali.
Molti serbatoi contenenti mezzo di coltura fornisce tessuto donatore e lo protegge dall'essiccazione durante il periodo di tempo iniziale procedendo con il vascolarizzazione. Questo film mostra il flusso di cellule del sangue di pollo in un centro renale di topo embrionale innestato al CAM di pollo e coltivato per sette giorni. Questo pannello di figure mostra che il nostro metodo di coltura CAM migliorato fornisce condizioni permissive per le cellule endoteliali derivate renali.
Le figure A e B mostrano che i reni embrionali coltivati per cinque giorni sulla coltura dell'intervallo di giorni sono stati innestati al cam di pollo per cinque giorni. La colorazione con anticorpi CD-31 specifici del mouse mostra che la rete cellulare endoteliale del centro renale innestato in CAM è più estesa che nel controllo laterale sinistro. Nella figura C vediamo che i vasi sanguigni dei topi macchiati con anticorpi CD-31 specifici del topo e questo è il massimo con i vasi sanguigni di pollo.
Le figure D ed E mostrano criosezioni di reni embrionali di topo coltivati sulla coltura di viaggio o cam di pollo per cinque giorni e macchiati con CD-31 e Hoechst. La vascucolatura glomeruli è più matura nei reni coltivati su CAM di pollo che nelle colture di controllo. La figura F mostra un rene embrionale di topo coltivato su CAM di un pollo GFP transgenico per sette giorni.
Le cellule endoteliali del topo sono macchiate con anticorpo CD-31 e possiamo osservare che la vascucolatura nei reni del topo xenotrapianti è per lo più ma non esclusivamente derivata dal topo. La nuova cultura della direzione fissa consente la coltivazione di reni embrionali e organoidi a una distanza impostata limitata. In una cultura di viaggio tradizionale, gli organi coltivati sono posizionati su un filtro che viene mantenuto in un'interfaccia di mezzo d'aria da una griglia metallica.
Questo metodo consente buone condizioni per lo sviluppo e la crescita, ma non è ottimale per l'imaging. Nella coltura della direzione fissa dell'insieme, l'organo coltivato viene premuto tra un fondo di vetro del piatto e una membrana e lo spessore di esso è controllato dalle perline di polistirolo che lavorano come distanziati qui. Gli organi in via di sviluppo possono essere immagini direttamente attraverso il vetro di copertura dando una migliore vista dell'organo.
Questo pannello di figure mostra che i reni embrionali e gli organoidi renali possono essere coltivati nel metodo di coltura della direzione fissa impostata. Immagini di campo luminoso di reni embrionali e organoidi renali al settimo giorno mostrano un normale sviluppo. Nella figura C, l'espressione GFB è stata attivata nei nefroni in via di sviluppo di un organoide renale dalla figura D mostra un rene con trauma una colorazione sul bocciolo euretrico e sei due colorazioni che segnano le cellule precursori del nefro.
Le figure E e F presentano il rene del topo coltivato per 12 giorni. Il trauma e la colorazione del nefro mostrano il bocciolo euretico e i podociti. Anche il film presenta un rene embrionale di MTMG, origine cree di Taiwan, dove il credo di Taiwan induce l'espressione GFB nelle cellule endoteliali.
Possiamo vedere che le cellule endoteliali renali sono presenti nel rene embrionale in via di sviluppo e la rete endoteliale può anche svilupparsi nel metodo di coltura. Nel pannello a destra, potete vedere come le cellule endoteliali migrano nella fessura vascolare di un nefrone da stadio a forma di S. Qui abbiamo presentato il protocollo migliorato per lo xenotrapianto di organoidi renali e reni embrionali al pollo CAM.
Questo protocollo aumenta significativamente la sopravvivenza dei rudimenti renali e anche delle loro cellule endoteliali intrinseche. Il metodo consente il flusso sanguigno al glomerulus in via di sviluppo. L'altro protocollo qui presentato è il metodo di coltura degli organi a direzione fissa che migliora la qualità dell'imaging e aiuta a studiare la genesi degli organelli a livello di singola cellula.
Le immagini ad alta risoluzione sono adatte per la segmentazione cellulare automatizzata e lo studio computerizzate del comportamento cellulare negli organoidi renali e nelle colture renali.
