La ricerca qui riportata è stata sostenuta in parte dal National Cancer Institute del National Institutes of Health sotto il premio no. R33 CA217702 e il programma IMSD (Initiative for Maximizing Student Development). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

I campioni di siero umano sono stati ottenuti da volontari consenzienti sotto l'approvazione dell'IRB e secondo i principi espressi nella Dichiarazione di Helsinki. I campioni sono stati codificati e de-identificati prima del trasferimento al laboratorio di analisi.
1. Preparazione del campione
<ol><li>Lisati di cellule HepG2
	<ol>
<li>Semina circa 10 x 106 cellule HepG2 per pallone in 16 palloni T75 con 14 ml di emEM media integrati con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e coltiva le cellule per 2 giorni.</li>
		<li>Preparare il tampone RIPA: in un tubo da 50 mL, aggiungere 1,5 mL di 5 M NaCl, 2,5 mL di 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL di reagente NP-40, quindi portare il volume finale a 50 mL con acqua DI.</li>
		<li>Preparare il tampone di lisi: aliquota 20 mL di tampone RIPA in un tubo da 50 mL e aggiungere 200 μL di una soluzione inibitore della proteasi 100x per inibire la degradazione delle proteine e dei lipidi. Conservare a 4 °C. NOTA: il tampone di lisi è compatibile con i reagenti TBARS e non interferisce con l'assorbanza a 532 nm. Se si prevede di utilizzare un tampone di lisi diverso o di aggiungere ingredienti aggiuntivi al tampone di lisi, è necessario eseguire studi preliminari di convalida per verificare che i componenti del tampone di lisi siano compatibili con il test TBARS.</li>
		<li>Rimuovere i fluidi contenenti il 10% di FBS e lavare le celle 2x con 5 ml di PBS freddo e sterile 1x.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di tampone di lisi ai palloni T75 contenenti le cellule e incubarli per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) con un vortice costante per garantire che il tampone sia ben distribuito.</li>
		<li>Raccogliere lisati in tubi di polipropilene a tappo a scatto da 2 mL opportunamente etichettati e incubare sul ghiaccio per 10 minuti.</li>
		<li>Ruotare i lisati a 5.000 x g per 10 minuti a RT per raccogliere i detriti cellulari e aspirare i supernatanti in un singolo tubo da 15 ml.</li>
		<li>Concentrare il surnatante di lisato cellulare quattro volte utilizzando uno Speed Vac a 50 °C e 3 mbar e fare aliquote di 94 μL ciascuna in tubi di polipropilene a tappo a scatto da 2 mL. Conservare i campioni a -80 °C fino a quando non vengono utilizzati per l'ossidazione in vitro e/o il test TBARS. NOTA: Per evitare di concentrare il surnatante di lisato cellulare, le cellule possono anche essere staccate usando 3 ml di 1x tripsina, neutralizzate con 6 mL di media e lavate 2x con 5 mL di PBS freddo. I pellet cellulari possono quindi essere ricostituiti in 250 μL di tampone di lisi e possono quindi essere eseguiti i passaggi 1.1.6 e 1.1.7.</li>
		<li>Preparare una soluzione madre di CuCl2 da 35 mM in acido acetico (pH = 4).<ol>
<li>Preparare la soluzione di acido acetico (pH = 4): diluire 1 μL di acido acetico glaciale in 100 ml di acqua DI (il pH dovrebbe essere di circa 4 ma confermarlo con un pHmetro). Aggiungere più acqua o acido acetico per regolare il pH a 4.</li>
			<li>Pesare circa 0,1936 g di cloruro di rame II e sciogliere in 10 ml della soluzione di acido acetico (pH = 4) per formare un brodo di CuCl2 da 144 mM. Aliquota 490 μL da questa soluzione e aggiungere a 1.510 μL di acido acetico (pH = 4) per ottenere una soluzione di CuCl2 da 35 mM.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aliquota 6 μL dalla soluzione madre cuCl2 da 35 mM e aggiungerla a sei campioni contenenti 94 μL di lisato cellulare per ottenere una concentrazione finale di CuCl2 di circa 2 mM. Aggiungere 6 μL di una soluzione di acido acetico (pH = 4) che non ha CuCl2 a sei campioni contenenti 94 μL di lisati cellulari da utilizzare come controlli. Il volume finale di lisato cellulare dovrebbe essere di 100 μL, che è quello che verrà utilizzato per il test TBARS. NOTA: La produzione della soluzione madre cuCl2 da 35 mM in acido acetico (pH = 4) è necessaria per evitare la precipitazione dell'idrossido di rame.</li>
		<li>Incubare i campioni in un forno a 37 °C per 24 ore ed eseguire un saggio TBARS su ciascun campione contenente un volume finale di 100 μL.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 1.1.9 e 1.1.11 2x in giorni separati per verificare la riproducibilità del test TBARS per i lisati cellulari HepG2.</li>
	</ol></li>
	<li>Lipoproteine a bassa densità NOTA: In genere, la lipoproteina a bassa densità (LDL) pre-purificata contiene una certa quantità di EDTA. I campioni LDL utilizzati qui contengono lo 0,01% di EDTA. L'EDTA può inibire l'ossidazione in vitro mediata da Cu(II) delle LDL. Quindi, potrebbe essere necessario rimuovere EDTA dai campioni LDL prima di esperimenti o analisi. I passaggi 1.2.1–1.2.5 descrivono questo processo. ATTENZIONE: l'idrossido di sodio è corrosivo e provoca irritazione alla pelle e agli occhi. Utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale.<ol>
<li>Aliquota 24 μL da uno stock di LDL da 5,51 mg/mL (concentrazione proteica determinata con metodo Lowry modificato utilizzando BSA come standard) in tubi di polipropilene a tappo a scatto da 1 mL opportunamente etichettati. Effettuare tutte le aliquote necessarie e conservare a 4 °C fino all'uso nel test di ossidazione e/o TBARS.</li>
		<li>Preparare un tampone HEPES da 10 mM in 0,15 M NaCl regolato a pH = 7 con perline NaOH: sciogliere 4,39 g di NaCl in 0,49 L di acqua, quindi aggiungere 1,19 g di HEPES. Sciogliere bene con una barra di agitazione. Aggiungere perline di idrossido di sodio fino a quando il pH è 7. Diluire a 0,5 L con acqua. Conservare il tampone a 4 °C e utilizzare entro 3 mesi.</li>
		<li>Aggiungere 476 μL del tampone HEPES da 10 mM in 0,15 M NaCl (pH = 7) ai campioni LDL aliquotati per portare il volume finale a 500 μL. Aggiungere un campione LDL diluito a un dispositivo filtro centrifugo da 0,5 mL con un taglio di peso molecolare di 100K.</li>
		<li>Centrifuga i campioni a 14.000 x g per 10 minuti a RT, lasciando un volume finale di ripetizione di circa 30 μL. Ricostituire i campioni in 480 μL del tampone HEPES da 10 mM in 0,15 M NaCl (pH = 7) e ruotare nuovamente a 14.000 x g per 10 minuti a RT. Eseguire questa fase 2 volte per un totale di quattro spin-through.</li>
		<li>Posizionare il dispositivo filtrante capovolto in un nuovo tubo di polipropilene a scatto da 2 mL e centrifugare a 1000 x g per 2 minuti per raccogliere il campione LDL (volume finale = circa 30 μL).</li>
		<li>Aliquotare il campione in un tubo da 1 mL opportunamente etichettato e aggiungere 20 μL di acqua a ciascun campione per ottenere un volume finale di 50 μL.</li>
		<li>Preparazione di soluzione madre cuCl2 da 200 μM in acido acetico (pH = 4)<ol>
<li>Preparare la soluzione di acido acetico (pH = 4): vedere il punto 1.1.9.1.</li>
			<li>Preparare una soluzione madre cuCl2 da 144 mM (vedere punto 1.1.9.2), quindi aliquotare 5,5 μL dal brodo CuCl2 da 144 mM e sciogliere in un volume finale di 4 mL di acido acetico (pH = 4) per ottenere la soluzione da 200 μM.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aliquota 2,7 μL dalla soluzione madre CuCl2 da 200 μM e aggiungerla a sei campioni contenenti 50 μL di LDL per ottenere una concentrazione finale di CuCl2 di ~10 μM. Aggiungere 2,7 μL da una soluzione di acido acetico (pH = 4) che non contiene CuCl2 a sei campioni contenenti 50 μL di LDL da utilizzare per i controlli.</li>
		<li>Incubare campioni LDL per 2 ore in forno a 37 °C. Dopo 2 ore, portare il volume finale a 100 μL per ogni campione con tampone HEPES da 10 mM in 0,15 M NaCl (pH = 7). Eseguire immediatamente un test TBARS.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 1.2.3–1.2.9 2x in due giorni diversi per testare la riproduttività del test TBARS.</li>
	</ol></li>
	<li>Siero umano
	<ol>
<li>Da un campione di siero umano, effettuare aliquote di 94 μL ciascuna in provette di polipropilene a tappo a scatto da 2 mL e conservare i campioni a -80 °C.</li>
		<li>Preparare una soluzione madre di CuCl2 da 35 mM in acido acetico (pH = 4): vedere il passaggio 1.1.9.</li>
		<li>Aliquota 6 μL dalla soluzione madre cuCl2 e aggiungerla a sei campioni contenenti 94 μL di siero umano per ottenere una concentrazione finale di CuCl2 di circa 2 mM. Aggiungere 6 μL di una soluzione di acido acetico (pH = 4) che non ha CuCl2 a sei campioni contenenti 94 μL di siero umano da utilizzare come controlli.</li>
		<li>Incubare campioni di siero umano per 24 ore in forno a 37 °C e determinare i livelli di ossidazione con il test TBARS (sezione 4).</li>
		<li>Ripetere i passaggi 1.3.2–1.3.4 2x in due giorni separati per determinare la riproducibilità del test TBARS.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparazione del reagente
ATTENZIONE: L'acido tiobarbiturico provoca irritazione della pelle e degli occhi e può essere dannoso per inalazione o assorbimento cutaneo. L'acido acetico può danneggiare gli organi interni se inalato. Preparare tutte le soluzioni acide in una cappa aspirante.
<ol><li>Preparazione di soluzione all'8,1% (p/v) di dodecilsolfato di sodio (SDS)<ol>
<li>Pesare 32,4 g di SDS e sciogliere in 350 ml di acqua DI in un becher. Utilizzare una barra di agitazione magnetica per sciogliere delicatamente la SDS ed evitare di creare bolle. Portare il volume finale a 400 ml con acqua DI e conservare la soluzione SDS presso RT. NOTA: qui viene preparata una soluzione SDS superiore all'8,1%; tuttavia, per 96 campioni, sono necessari solo circa 20 ml della soluzione SDS all'8,1%. Preparare questa soluzione in base al numero di campioni analizzati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di tampone di acetato di sodio 3,5 M (pH = 4)<ol>
<li>Diluire 100 mL di acido acetico glaciale in 350 mL di acqua DI in un becher. Utilizzare una barra magnetica per scioglierla delicatamente.</li>
		<li>Preparare una soluzione di NaOH da 6,5 M utilizzando perline di idrossido di sodio in acqua. Sciogliere 13 g di perline NaOH in 40 ml di acqua DI e portare ad un volume finale di 50 ml con acqua DI.</li>
		<li>Aggiungere lentamente circa 46 mL della soluzione di NaOH da 6,5 M alla soluzione di acido acetico mentre si mescola con la barra di agitazione (questo dovrebbe aumentare il pH a 4, ma confermare aggiungendo lentamente la soluzione di NaOH durante la misurazione utilizzando un pHmetro).</li>
		<li>Portare il volume finale a 500 ml con acqua DI e conservare il tampone di acetato di sodio a RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di soluzione acquosa allo 0,8% di acido tiobarbiturico (aggiustata a pH = 4) NOTA: In questa fase, la preparazione dell'acido tiobarbiturico è ottimizzata per grandi volumi, poiché verrà analizzato un gran numero di campioni (108 campioni, esclusi gli standard). Preparare questa soluzione in base al numero di campioni pianificati per l'analisi.<ol>
<li>Preparare una soluzione di idrossido di sodio 5 M utilizzando perline di idrossido di sodio e acqua: sciogliere 4 g di perline di idrossido di sodio in un volume finale di 20 ml di acqua. Conservare in un contenitore di plastica. Questa soluzione deve essere preparata al momento per ogni lotto.</li>
		<li>Peso 4 g di acido tiobarbiturico e aggiungere 450 ml di acqua DI. Utilizzare una barra magnetica per scioglierla delicatamente. NOTA: questa soluzione verrà infine portata a un volume totale di 500 ml.</li>
		<li>Mentre si scioglie l'acido tiobarbiturico con una barra di agitazione, aggiungere (lentamente e in modo goccioso) circa 3 ml della soluzione di NaOH da 5 M con incrementi di 100 μL. Dopo aver aggiunto la soluzione di NaOH, le particelle di acido tiobarbiturico inizieranno a dissolversi.</li>
		<li>Se le particelle di acido tiobarbiturico non sono ancora completamente disciolte, aggiungere più della soluzione di NaOH 5 M con incrementi di 100 μL fino a quando tutte le particelle di acido tiobarbiturico sono completamente disciolte. Per questo particolare volume di soluzione, viene aggiunto un totale di 4 mL della soluzione di NaOH da 5 M per sciogliere completamente le particelle di acido tiobarbiturico. NOTA: A questa concentrazione, l'acido tiobarbiturico non si dissolve completamente a meno che il pH non sia quasi 4.</li>
		<li>Smettere di aggiungere NaOH dopo che tutto l'acido tiobarbiturico si è completamente sciolto. Evitare di superare un pH di 4. Il pH finale può essere verificato prendendo 1 μL dalla soluzione di acido tiobarbiturico miscelante e posizionandola su carta pH.</li>
		<li>Portare il volume finale a 500 ml con acqua DI e conservare la soluzione acquosa di acido tiobarbiturico allo 0,8% a RT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparazione standard del campione di Malondialdeide bis(dimetilacetale)
NOTA: Malondialdeide (MDA) è instabile e non disponibile in commercio. Tuttavia, ci sono diverse forme chimiche di MDA che sono disponibili in commercio, come il sale di tetrabutilammonio MDA, MDA bis (dimetil acetale) e MDA bis (dietil acetale). Di queste tre forme chimiche, MDA bis (dimetilacetale) è usato qui, perché la maggior parte degli studi utilizza questo stesso standard21,22. Se si sceglie di utilizzare le altre due forme chimiche di MDA, è necessario effettuare una previa convalida della loro idoneità.
<ol><li>Preparare una soluzione madre di MDA bis (dimetilacetale) da 550 μM diluendo 92 μL di MDA bis (dimetilacetale) puro in 1 L di acqua DI. Utilizzare una barra magnetica per mescolare accuratamente la soluzione per 10 minuti. Conservare la soluzione a 4 °C e utilizzarla entro 1 mese.</li>
	<li>Preparare un MDA bis (dimetilacetale) da 200 μM diluendo 726 μL dallo stock di 550 μM MDA bis (dimetilacetale) in 1274 μL di acqua DI. Questa soluzione di MDA bis (dimetilacetale) da 200 μM deve essere preparata fresca ogni volta che viene eseguito un test TBARS.</li>
	<li>Preparazione della curva standard: prendere otto tubi di polipropilene a scatto da 2 ml ed etichettarli con le lettere da A a H. Aggiungere MDA bis (dimetilacetale) dal brodo da 200 μM e diluire in acqua come descritto nella Tabella 1.</li>
	<li>Prendere otto tubi di vetro (13 mm x 100 mm) ed etichettarli A-H, quindi aggiungere 100 μL di standard ai tubi corrispondenti. Eseguire sei repliche per lo standard vuoto (campione A) per calcolare i limiti di rilevamento del test TBARS. NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui per non più di 1 ora.</li>
</ol>4. Test TBARS
NOTA: una volta avviato il test TBARS, deve essere terminato senza fermarsi.
<ol><li>Prendi tutti i tubi di vetro necessari per il numero di campioni da analizzare ed etichettali con i nomi dei campioni. Quindi, aggiungere 100 μL di ciascun campione preparato (come descritto sopra) a ciascun tubo di vetro.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di SDS all'8,1% a ciascun campione e standard e ruotare delicatamente il tubo di vetro con un movimento circolare per mescolare il campione.</li>
	<li>Aggiungere 1,5 mL del tampone di acetato di sodio 3,5 M (pH = 4) a ciascun campione e standard.</li>
	<li>Aggiungere 1,5 mL della soluzione acquosa di acido tiobarbiturico allo 0,8% (pH = 4) a ciascun campione e standard.</li>
	<li>Portare il volume finale a 4 mL per ogni campione e standard aggiungendo 700 μL di acqua DI.</li>
	<li>Tappare saldamente ogni tubo di vetro e incubare in un blocco riscaldante impostato a 95 °C per 1 ora. Coprire i tubi di vetro con un foglio di alluminio per evitare la formazione di condensa nella parte superiore dei tubi.</li>
	<li>Rimuovere i tubi di vetro dal blocco riscaldante e incubare sul ghiaccio per 30 minuti.</li>
	<li>Centrifugare campioni e standard a 1500 x g per 10 min a 4 °C. Dopo la centrifugazione, mantenere i tubi di vetro contenenti i campioni e gli standard a RT. NOTA: mantenere i campioni su ghiaccio o a 4 °C farà precipitare l'intero campione o standard.</li>
	<li>Immediatamente dopo la centrifugazione, aliquota 150 μL di surnatante da ciascun tubo e mettere in un pozzo separato di una piastra da 96 pozzetti.</li>
	<li>Rimuovere eventuali bolle da ciascun pozzetto utilizzando una punta della pipetta. NOTA: la presenza di bolle produrrà letture di assorbanza incoerenti, portando a un'elevata imprecisione del saggio.</li>
	<li>Leggere assorbanze a 532 nm. Sottrarre la lettura media di assorbanza dei campioni in bianco da tutte le altre letture di assorbanza.</li>
	<li>Create una curva standard tracciando le letture di assorbanza sottratte in bianco a 532 nm rispetto alla concentrazione nota di ciascuno standard. Adatta i punti dati utilizzando la regressione lineare. Calcolare concentrazioni di campioni sconosciute utilizzando l'equazione della linea di regressione lineare ottenuta dalla curva standard.</li>
</ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-Radical+Damage+to+Lipids,+Amino-Acids,+Carbohydrates+and+Nucleic-Acids+Determined+by+Thiobarbituric+Acid+Reactivity.">Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity.</a> International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).</li><li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+malondialdehyde+as+an+oxidative+stress+biomarker+in+oral+and+systemic+diseases.">Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases.</a> J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).</li><li>Halliwell, B., Whiteman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+species+and+oxidative+damage+in+vivo+and+in+cell+culture:+How+should+you+do+it+and+what+do+the+results+mean.">Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean.</a> British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).</li><li>Lee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+oxidative+stress+in+human+cardiovascular+disease:+methodological+aspects+and+considerations.">Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations.</a> Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).</li><li>Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+density+lipoprotein+cytotoxicity+induced+by+free+radical+peroxidation+of+lipid.">Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid.</a> Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).</li><li>Guzm&#225;n-Chozas, M., Vicario-Romero, I. 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New Evidence for a Multistep Mechanism.</a> Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).</li><li>Jeffs, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delta-S-Cys-Albumin:+A+Lab+Test+that+Quantifies+Cumulative+Exposure+of+Archived+Human+Blood+Plasma+and+Serum+Samples+to+Thawed+Conditions.">Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).</li><li>Yagi, K., Armstrong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Assay+for+the+Level+of+Total+Lipid+Peroxides+in+Serum+or+Plasma.">Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma.</a> Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. , 101-106 (1998).</li><li>Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reaction+between+thiobarbituric+acid+and+the+oxidation+products+of+certain+lipides.">The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides.</a> Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).</li><li>Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thiobarbituric+acid+reagent+as+a+test+for+the+oxidation+of+unsaturated+fatty+acids+by+various+agents.">The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents.</a> Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).</li><li>Kwon, T. W., Watts, B. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+analysis+of+malondialdehyde+in+human+body+fluids.">Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids.</a> Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).</li><li>Jo, C., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorometric+Analysis+of+2-Thiobarbituric+Acid+Reactive+Substances+in+Turkey.">Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey.</a> Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).</li><li>Tsikas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+validation+and+biomedical+applications+of+stable-isotope+dilution+GC-MS+and+GC-MS/MS+techniques+for+circulating+malondialdehyde+(MDA)+after+pentafluorobenzyl+bromide+derivatization:+MDA+as+a+biomarker+of+oxidative+stress+and+its+relation+to+15(S)-8-iso-prostaglandin+F2&#945;+and+nitric+oxide+(NO).">Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2&#945; and nitric oxide (NO).</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).</li><li>Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+artifactual+elevation+of+lipid+peroxidation+products+(F+2-isoprostanes)+in+plasma+during+collection+and+storage.">Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage.</a> Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).</li><li>Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+instability+of+glycated+albumin:+A+role+for+autoxidative+glycation.">Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).</li><li>Lee, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malondialdehyde+in+Stored+Plasma.">Malondialdehyde in Stored Plasma.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).</li><li>Tsikas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+GC-MS/MS+measurement+of+malondialdehyde+and+4-hydroxy-2-nonenal+in+human+plasma:+Effects+of+long-term+L-arginine+administration.">Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration.</a> Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse da divulgare.

Nonostante i suoi limiti1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 e la mancanza di idoneità al confronto tra laboratori, il test TBARS è uno dei più <sup class=...

La perossidazione lipidica è un processo in cui i radicali liberi, come le specie reattive dell'ossigeno e le specie reattive dell'azoto, attaccano i doppi legami carbonio-carbonio nei lipidi, un processo che comporta l'estrazione di un idrogeno da un carbonio e l'inserimento di una molecola di ossigeno. Questo processo porta a una miscela di prodotti complessi tra cui radicali lipidici perossilici e idroperossidi come prodotti primari, nonché malondialdeide (MDA) e 4-idrossinonenale come prodotti secondari predominanti1.
MDA è stato ampiamente utilizzato nella ricerca biomedica come marcatore di perossidazione lipidica a causa della sua facile reazione con l'acido tiobarbiturico (TBA). La reazione porta alla formazione di MDA-TBA2, un coniugato che assorbe nello spettro visibile a 532 nm e produce un colore rosso-rosa2. Altre molecole derivate dalla perossidazione lipidica oltre all'MDA possono anche reagire con il TBA e assorbire la luce a 532 nm, contribuendo al segnale di assorbimento complessivo che viene misurato. Allo stesso modo, MDA può reagire con la maggior parte delle altre principali classi di biomolecole, limitando potenzialmente la sua accessibilità per la reazione con TBA3,4. Come tale, questo test tradizionale è semplicemente considerato per misurare "sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico" o TBARS5.
Se applicato e interpretato correttamente, il test TBARS è generalmente considerato un buon indicatore dei livelli complessivi di stress ossidativo in un campione biologico6. Sfortunatamente, come documentato da Khoubnasabjafari e altri, il test TBARS è spesso condotto e interpretato in modi che facilitano conclusioni dubbie3,4,7,8,9,10,11. Le cause di ciò sono radicate principalmente nelle variabili pre-analitiche correlate al campione e nella mancanza di robustezza del saggio che vieta variazioni apparentemente minori nel protocollo del saggio senza cambiamenti sostanziali nei risultati del test1,7,12,13.
Le variabili preanalitiche correlate alla manipolazione e alla conservazione dei biocampioni (ad esempio, plasma sanguigno mantenuto temporaneamente a -20 °C)14,15 possono avere un impatto importante sui risultati del test TBARS16,17; tanto che i risultati del test TBARS non dovrebbero essere confrontati tra diversi laboratori a meno che non siano garantiti da espliciti dati di convalida analitica interlaboratorio. Questa raccomandazione è simile a come i western blots sono comunemente usati e interpretati. I confronti delle densità di banda sono validi per gli studi all'interno del blot e forse all'interno del laboratorio, ma il confronto delle densità di banda tra i laboratori è generalmente considerato una pratica non valida.
Alcuni ricercatori hanno suggerito che l'MDA misurato dal test TBARS semplicemente non soddisfa i criteri analitici o clinici richiesti da un biomarcatore accettabile3,9,10,18,19. Infatti, se il saggio non fosse stato sviluppato oltre 50 anni fa, probabilmente non avrebbe ottenuto l'uso diffuso e la tacita accettabilità che ha oggi. Sebbene esistano altri saggi con maggiore sensibilità analitica, specificità e robustezza utilizzati per determinare lo stress ossidativo, il saggio TBARS basato sull'assorbanza a 532 nm rimane di gran lunga uno dei saggi più comunemente usati per la determinazione della perossidazione lipidica20 e quindi la valutazione dello stress ossidativo.
Il test TBARS può essere trovato solo come un kit costoso (oltre 400 dollari USA), in cui le istruzioni non forniscono informazioni dettagliate sulla maggior parte delle concentrazioni dei reagenti utilizzati. Inoltre, i reagenti forniti possono essere utilizzati solo per un esperimento, perché è possibile realizzare una sola curva standard colorimetrica per kit. Questo può essere problematico per i ricercatori che intendono determinare i livelli di ossidazione all'interno di pochi campioni in diversi punti temporali, perché la stessa curva standard non può essere utilizzata più volte. Quindi, è necessario acquistare più kit per più esperimenti. Attualmente, a meno che non venga acquistato un kit costoso, non è disponibile un protocollo dettagliato su come eseguire un test TBARS. Alcuni ricercatori in passato hanno vagamente descritto come eseguire un test TBARS21,22, ma né un protocollo completamente dettagliato né un video completo su come condurre il test TBARS senza un kit costoso è disponibile in letteratura.
Qui riportiamo una metodologia dettagliata e convalidata analiticamente per lo scopo su come eseguire un test TBARS in modo semplice, riproducibile ed economico. I cambiamenti nella perossidazione lipidica del siero umano, dei lisati HepG2 e delle lipoproteine a bassa densità dopo il trattamento con ioni Cu(II) sono dimostrati come applicazioni illustrative per il test TBARS. I risultati dimostrano che questo test TBARS è coerente e riproducibile su base giornaliera.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Sterile PBS pH 7.4 1 L</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>101642--262</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL self-standing centrifuge tube</td>
			<td>Corning, NY</td>
			<td>CLS430897</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, MA</td>
			<td>280895</td>
			<td>To measure absorbance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device</td>
			<td>Fisher Scientific, NH</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td>LDL purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps for glass tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, MA</td>
			<td>14-930-15D</td>
			<td>for TBARS assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper II Chloride</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>222011-250G</td>
			<td>to induce oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm)</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>53283-800</td>
			<td>for TBARS assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium (EMEM)</td>
			<td>ATCC, VA</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>HepG2 cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf, NY</td>
			<td>22363204</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Genesee Sceitific, CA</td>
			<td>22363352</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum US Source</td>
			<td>Omega Scientific, CA</td>
			<td>FB-11</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>27225-1L-R</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific, MA</td>
			<td>87786</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td>LDL solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 Cells</td>
			<td>ATCC, VA</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Biological matrix prototype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific, NH</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legend Micro 17 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific, MA</td>
			<td>75002431</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Density Lipoprotein, Human Plasma</td>
			<td>Athens Research &#38; Technology, GA</td>
			<td>12-16-120412</td>
			<td>Biological matrix prototype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>58948-025</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malondialdehyde bis (dimethyl acetal)</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>8207560250</td>
			<td>TBARS Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan Go Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Fisher Scientific, NH</td>
			<td>51119200</td>
			<td>To measure absorbance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>EMD Millipore Corp, MA</td>
			<td>492016-100ML</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>436143-100G</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>367176-2.5KG</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific, MA</td>
			<td>SC250EXP</td>
			<td>For concentrating cell lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap</td>
			<td>USA Scientific, FL</td>
			<td>658175</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiobarbituric Acid</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>T5500-100G</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS base</td>
			<td>Fluka, GA</td>
			<td>93362</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (1x)</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>16777-166</td>
			<td>To detach HepG2 cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of oxidative stress in biological samples using the thiobarbituric acid reactive substances assay

Nonostante la sua limitata specificità analitica e robustezza, il saggio delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico (TBARS) è stato ampiamente utilizzato come metrica generica della perossidazione lipidica nei fluidi biologici. È spesso considerato un buon indicatore dei livelli di stress ossidativo all'interno di un campione biologico, a condizione che il campione sia stato correttamente maneggiato e conservato. Il test prevede la reazione di prodotti di perossidazione lipidica, principalmente malondialdeide (MDA), con acido tiobarbiturico (TBA), che porta alla formazione di addotti MDA-TBA2 chiamati TBARS. TBARS produce un colore rosso-rosa che può essere misurato spettrofotometricamente a 532 nm. Il test TBARS viene eseguito in condizioni acide (pH = 4) e a 95 °C. L'MDA puro è instabile, ma queste condizioni consentono il rilascio di MDA da MDA bis (dimetil acetale), che viene utilizzato come standard analitico in questo metodo. Il test TBARS è un metodo semplice che può essere completato in circa 2 ore. La preparazione dei reagenti di analisi è descritta in dettaglio qui. I ricercatori attenti al budget possono utilizzare questi reagenti per più esperimenti a basso costo piuttosto che acquistare un costoso kit di analisi TBARS che consente solo la costruzione di una singola curva standard (e quindi può essere utilizzato solo per un esperimento). L'applicabilità di questo test TBARS è dimostrata nel siero umano, nelle lipoproteine a bassa densità e nei lisati cellulari. Il test è coerente e riproducibile e possono essere raggiunti limiti di rilevazione di 1,1 μM. Vengono fornite raccomandazioni per l'uso e l'interpretazione del test spettrofotometrico TBARS.

In condizioni acide (pH = 4) e a 95 °C, la malondialdeide (MDA) bis(dimetil acetale) produce MDA23. MDA e congeneri chimici strettamente correlati reagiscono con due molecole di acido tiobarbiturico (TBA) per produrre composti chiamati sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico (TBARS), che danno un colore rosso-rosa e hanno un λmax di assorbanza a 532 nm (Figura 1, Figura 2). Utilizzando MDA bis (dimetilacetale) come standa...

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Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay

L'obiettivo del test delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico è quello di valutare lo stress ossidativo in campioni biologici misurando la produzione di prodotti di perossidazione lipidica, principalmente malondialdeide, utilizzando la spettrofotometria a lunghezza d'onda visibile a 532 nm. Il metodo qui descritto può essere applicato al siero umano, ai lisati cellulari e alle lipoproteine a bassa densità.

Valutazione dello stress ossidativo in campioni biologici utilizzando il test delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico

Despite its limited analytical specificity and ruggedness, the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay has been widely used as a generic ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

27.3K Views.  Arizona State University. L'obiettivo del test delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico è quello di valutare lo stress ossidativo in campioni biologici misurando la produzione di prodotti di perossidazione lipidica, principalmente malondialdeide, utilizzando la spettrofotometria a lunghezza d'onda visibile a 532 nm. Il metodo qui descritto può essere applicato al siero umano, ai lisati cellulari e alle lipoproteine a bassa densità.

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Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

Metabolomica non mirati da fonti biologiche Uso UltraPerformance cromatografia liquida-spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Ricerca

Chimica

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; therefore their preparation should be conducted under an inert atmosphere. Evaluation of the anticancer activity of these complexes can be achieved by the MTT assay.
The MTT assay is a colorimetric viability assay based on enzymatic reduction of the MTT molecule to formazan when it is exposed to viable cells. The outcome of the reduction is a color change of the MTT molecule. Absorbance measurements relative to a control determine the percentage of remaining viable cancer cells following their treatment with varying concentrations of a tested compound, which is translated to the compound anticancer activity and its IC50 values. The MTT assay is widely common in cytotoxicity studies due to its accuracy, rapidity, and relative simplicity.
Herein we present a detailed protocol for the synthesis of air sensitive metal based drugs and cell viability measurements, including preparation of the cell plates, incubation of the compounds with the cells, viability measurements using the MTT assay, and determination of IC50 values.

A method for synthesis of air-sensitive titanium and vanadium anticancer agents is described, along with the evaluation of their cytotoxic activity towards human cancer cell line by the MTT Assay.

Antitumorali metallo Complessi: Sintesi e citotossicità valutazione da parte del saggio MTT

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Supercritical Nitrogen Processing for the Purification of Reactive Porous Materials

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. Herein, nitrogen is presented as a novel supercritical drying fluid for specialized applications such as in the processing of reactive porous materials, where carbon dioxide and other fluids are not appropriate due to their higher chemical reactivity. Nitrogen exhibits similar physical properties in the near-critical region of its phase diagram as compared to carbon dioxide: a widely tunable density up to ~1 g ml-1, modest critical pressure (3.4 MPa), and small molecular diameter of ~3.6 &#197;. The key to achieving a high solvation power of nitrogen is to apply a processing temperature in the range of 80-150 K, where the density of nitrogen is an order of magnitude higher than at similar pressures near ambient temperature. The detailed solvation properties of nitrogen, and especially its selectivity, across a wide range of common target species of extraction still require further investigation. Herein we describe a protocol for the supercritical nitrogen processing of porous magnesium borohydride.

Nitrogen is an effective supercritical fluid for extraction or drying processes due to its small molecular size, high density in the near-liquid supercritical regime, and chemical inertness. We present a supercritical nitrogen drying protocol for the purification treatment of reactive, porous materials.

Elaborazione azoto supercritica per la purificazione di reattivi materiali porosi

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. ...

Using Polystyrene-block-poly(acrylic acid)-coated Metal Nanoparticles as Monomers for Their Homo- and Co-polymerization

We present a template-free method for &#8220;polymerizing&#8221; nanoparticles into long chains without side branches. A variety of nanoparticles are encapsulated in polystyrene-block-poly(acrylic acid) (PSPAA) shells and then used as monomers for their self-assembly. Spherical PSPAA micelles upon acid treatment are known to assemble into cylindrical micelles. Exploiting this tendency, the core-shell nanoparticles are induced to aggregate, coalesce, and then transform into long chains. When more than one type of nanoparticles are used, random and block &#8220;copolymers&#8221; of nanoparticles can be obtained. Detailed procedures are reported for the PSPAA encapsulation of nanoparticles, homo- and co-polymerization of the core-shell nanoparticles, separation and purification of the resulting nanoparticle chains. Transformations of single-line chains into double- and triple-line chains are also presented. The synergy between the polymer shell and the embedded nanoparticles leads to an unusual chain-growth polymerization mode, giving long nanoparticle chains that are distinct from the products of the traditional step-growth aggregation process.

Using Polystyrene-block-polyacrylic acid-coated Metal Nanoparticles as Monomers for Their Homo- and Co-polymerization

We report protocols for &#8220;polymerizing&#8221; various types of polymer-encapsulated metal nanoparticles into long chains of &#8220;homo-&#8220; and &#8220;co-polymers&#8221;.

Utilizzando Polystyrene-<em&gt; Blocco</em&gt; -poly (Acido acrilico) Rivestiti metallo Nanoparticelle come monomeri per loro omo- e co-polimerizzazione

We present a template-free method for &#8220;polymerizing&#8221; nanoparticles into long chains without side branches. A variety of nanoparticles are ...

Photochemical Oxidative Growth of Iridium Oxide Nanoparticles on CdSe@CdS Nanorods

We demonstrate a procedure for the photochemical oxidative growth of iridium oxide catalysts on the surface of seeded cadmium selenide-cadmium sulfide (CdSe@CdS) nanorod photocatalysts. Seeded rods are grown using a colloidal hot-injection method and then moved to an aqueous medium by ligand exchange. CdSe@CdS nanorods, an iridium precursor and other salts are mixed and illuminated. The deposition process is initiated by absorption of photons by the semiconductor particle, which results with formation of charge carriers that are used to promote redox reactions. To insure photochemical oxidative growth we used an electron scavenger. The photogenerated holes oxidize the iridium precursor, apparently in a mediated oxidative pathway. This results in the growth of high quality crystalline iridium oxide particles, ranging from 0.5 nm to about 3 nm, along the surface of the rod. Iridium oxide grown on CdSe@CdS heterostructures was studied by a variety of characterization methods, in order to evaluate its characteristics and quality. We explored means for control over particle size, crystallinity, deposition location on the CdS rod, and composition. Illumination time and excitation wavelength were found to be key parameters for such control. The influence of different growth conditions and the characterization of these heterostructures are described alongside a detailed description of their synthesis. Of significance is the fact that the addition of iridium oxide afforded the rods astounding photochemical stability under prolonged illumination in pure water (alleviating the requirement for hole scavengers).

A protocol for the photochemical oxidative growth of small crystalline iridium oxide nanoparticles on the surface of CdSe@CdS seeded rod nanoparticles is presented.

Fotochimica ossidativa crescita di Iridium ossido di nanoparticelle su CdSe @ CdS Nanorods

We demonstrate a procedure for the photochemical oxidative growth of iridium oxide catalysts on the surface of seeded cadmium selenide-cadmium sulfide ...

The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and characterize microbial communities in environmental and biological systems. These measurements are even enabling enhanced analyses of complex soil microbial communities, which are the most complex microbial systems known to date. Multi-omic analyses, however, do have sample preparation challenges, since separate extractions are typically needed for each omic study, thereby greatly amplifying the preparation time and amount of sample required. To address this limitation, a 3-in-1 method for the simultaneous extraction of metabolites, proteins, and lipids (MPLEx) from the same soil sample was created by adapting a solvent-based approach. This MPLEx protocol has proven to be both simple and robust for many sample types, even when utilized for limited quantities of complex soil samples. The MPLEx method also greatly enabled the rapid multi-omic measurements needed to gain a better understanding of the members of each microbial community, while evaluating the changes taking place upon biological and environmental perturbations.

A protocol is presented for simultaneously extracting metabolites, proteins, and lipids from a single soil sample, allowing reduced sample preparation times and enabling multi-omic mass spectrometry analyses of samples with limited quantities.

Il protocollo MPLEx Multi-omic nell'analisi di campioni di terreno

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and ...

Separation of Aldehydes and Reactive Ketones from Mixtures Using a Bisulfite Extraction Protocol

The purification of organic compounds is an essential component of routine synthetic operations. The ability to remove contaminants into an aqueous layer by generating a charged structure provides an opportunity to use extraction as a simple purification technique. By combining the use of a miscible organic solvent with saturated sodium bisulfite, aldehydes and reactive ketones can be successfully transformed into charged bisulfite adducts that can then be separated from other organic components of a mixture by the introduction of an immiscible organic layer. Here, we describe a simple protocol for the removal of aldehydes, including sterically-hindered neopentyl aldehydes and some ketones, from chemical mixtures. Ketones can be separated if they are sterically unhindered cyclic or methyl ketones. For aliphatic aldehydes and ketones, dimethylformamide is used as the miscible solvent to improve removal rates. The bisulfite addition reaction can be reversed by basification of the aqueous layer, allowing for the re-isolation of the reactive carbonyl component of a mixture.

Here, we present a protocol to remove aldehydes and reactive ketones from mixtures by a liquid-liquid extraction protocol directly with saturated sodium bisulfite in a miscible solvent. This combined protocol is rapid and facile to perform. The aldehyde or ketone can be re-isolated by the basification of the aqueous layer.

Separazione di aldeidi e chetoni reattive da miscele utilizzando un protocollo di estrazione di bisolfito

The purification of organic compounds is an essential component of routine synthetic operations. The ability to remove contaminants into an aqueous layer ...

Reactive Inkjet Printing and Propulsion Analysis of Silk-based Self-propelled Micro-stirrers

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The resulting devices are an example of self-propelled objects capable of generating motion without external actuation and have potential applications in medicine and environmental sciences for a variety of purposes ranging from micro-stirring, targeted therapeutic delivery, to water remediation (e.g., cleaning oil spills). This method employs reactive inkjet printing to generate well-defined small-scale solid silk structures by converting water soluble regenerated silk fibroin (silk I) to insoluble silk fibroin (silk II). These structures are also selectively doped in specific regions with the enzyme catalase in order to produce motion via bubble generation and detachment. The number of layers printed determines the three-dimensional (3D) structure of the device, and so here the effect of this parameter on the propulsive trajectories is reported. The results demonstrate the ability to tune the motion by varying the dimensions of the printed structures.

This protocol demonstrates the ability to utilize reactive inkjet printing to print self-motile biocompatible and environmentally friendly micro-stirrers for use in biomedical and environmental applications.

Stampa a getto d'inchiostro reattiva e analisi di propulsione di micro-agitatori semoventi a base di seta

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

Sintesi e Bioconjugation di tiolo-reattive reagenti per la creazione del sito-selettivamente per volta efattori

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands for in vivo investigations. Within this protocol, a robust and reliable remote-controlled radiosynthesis of [11C]SNAP-7941, an antagonist to the melanin-concentrating hormone receptor 1, is described. The radiosynthesis starts with cyclotron produced [11C]CO2 that is subsequently further reacted via a gas-phase transition to [11C]CH3OTf. Then, this reactive intermediate is introduced to the precursor solution and forms the respective radiotracer. Chemical as well as the radiochemical purity are determined by means of RP-HPLC, routinely implemented in the radiopharmaceutical quality control process. Additionally, the molar activity is calculated as it is a necessity for the following real-time kinetic investigations. Furthermore, [11C]SNAP-7941 is applied to MDCKII-WT and MDCKII-hMDR1 cells for evaluating the impact of P-glycoprotein (P-gp) expression on cell accumulation. For this reason, the P-gp expressing cell line (MDCKII-hMDR1) is either used without or with blocking prior to experiments by means of the P-gp substrate (&#177;)-verapamil and the results are compared to the ones observed for the wildtype cells. The overall experimental approach demonstrates the importance of a precise time-management that is essential for every preclinical and clinical study using PET tracers radiolabelled with short-lived nuclides, such as carbon-11 (half-life: 20 min).

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Here, we represent a protocol for the fully automated radiolabelling of [11C]SNAP-7941 and the analysis of the real-time kinetics of this PET-tracer on P-gp expressing and non-expressing cells.

Aspetto tecnico della sintesi automatizzata e valutazione cinetica in tempo reale di [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...