Name: isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2016-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
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Questo progetto è stato finanziato dal Programma UCSF per Breakthrough Ricerca Biomedica (finanziato in parte dalla Fondazione Sandler), il NIH Pathway to Independence Award (R00HL114738), e la Fondazione Edward Mallinckrodt Jr.. JJ è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dal NIH (T32HL007731). Gli autori sono gli unici responsabili del contenuto di questo lavoro, che non necessariamente rappresentano le opinioni ufficiali del NIH.

Tutte le procedure descritte qui sono stati approvati dalla Utilizzo e manutenzione Comitato istituzionale degli animali presso l&#39;Università della California, San Francisco. NOTA: Brevemente, dopo estrazione cuore dal torace mouse, coronarica perfusione retrograda viene utilizzato per digerire efficientemente la matrice extracellulare con collagenasi e proteasi XIV. I ventricoli sono poi isolate, dissociato meccanicamente e filtrati in una sospensione di cellule singole. Gravità sedimentazione viene eseguita per isolare cardiomiociti, che sono separati da cellule stromali come fibroblasti e cellule endoteliali da loro alta densità. I cardiomiociti purificati possono essere coltivate per settimane su polistirolo laminina rivestite e trasdotte con vettori genici adenovirus. Isolamento 1. Cardiomyocyte <ol><li> Preparare Buffer, Stazione chirurgica e perfusione Apparatus <ol><li> Preparare buffer e dei media in base alla TabLe 1. </li><li> Accendere bagno di acqua circolante, impostare la temperatura di ingresso in modo che l&#39;uscita della camicia d&#39;acqua riscaldata raggiunge una temperatura di 37 ° C. </li><li> sistema di perfusione pulito da vampate di calore con il 70% di etanolo. Quindi rimuovere tutte le tracce di etanolo dal sistema mediante flussaggio con diversi volumi di acqua sterile. </li><li> Caricare il sistema di perfusione con tampone perfusione (Tabella 1). acqua in primo luogo di scarico dal sistema, poi sciacquare con 2 volumi di tampone perfusione. Poi riempire lo spazio morto con tampone perfusione tale che la colonna interna della giacca di calore è riempita con tampone perfusione, ma la camera debubbling è vuoto. SUGGERIMENTO: Assicurarsi che non ci siano bolle d&#39;aria presenti nella riga sotto la camera debubbling. Per rimuovere le bolle recalcitranti, coinvolgere tutti i rubinetti e permettere la pressione per costruire all&#39;interno della linea per alcuni secondi. Quindi rilasciare il rubinetto inferiore, consentendo il buffer di perfusione ad alta pressione del getto dalla presa; il rapido flusso e Turbulence contribuirà a sloggiare le bolle che vengono catturati vicino alla presa di perfusione. </li><li> Preparare una siringa con ago da utilizzare per incannulazione aortica. Collegare un ago smussato 18 G per una siringa da 1 ml riempita con tampone di perfusione. Rimuovere le bolle d&#39;aria e fissare il gruppo siringa per un braccio dell&#39;illuminatore dissezione miscroscope con nastro laboratorio. SUGGERIMENTO: per creare un ago ended smussato da un ago smussato, transetto l&#39;albero ago con tronchese. Poi affinare la punta con una pietra levigatura fino a quando la punta è piatta. NOTA: per ridurre lo slittamento dell&#39;aorta dall&#39;ago durante incannulazione, irruvidire l&#39;albero dell&#39;ago incannulazione usando una lama di rasoio. Fissare l&#39;ago dal mozzo e albero superiore, poi vide il rasoio e indietro perpendicolarmente all&#39;asse lungo dell&#39;albero dell&#39;ago durante la rotazione fino a diversi solchi ricavati da 1 cm dalla punta dell&#39;albero dell&#39;ago. Passare a un nuovo rasoio quando la lama diventa opaco. </li><li> Posizionare un pulitopetri piatto sotto il microscopio da dissezione per contenere il cuore durante l&#39;incannulamento. Posizionare il braccio illuminatore tale che la punta della cannula è vicino al bordo del campo visivo, ma non ostacolare la dissezione. Assicurarsi che la punta della cannula è sotto il bordo della capsula di Petri. NOTA: Per aiutare immobilizzare il cuore durante la dissezione, posizionare un piccolo (~ 5 - 7 cm 2) quadrato di 215 micron di maglia nella capsula di Petri. Quando il cuore è posto su questa rete, creerà attrito per ridurre scorrimento e rotazione del cuore durante manipolazione meccanica. </li><li> Tie 2 punti di sutura con sciolti nodo semplice doppio intorno al fulcro della cannula da utilizzare per il fissaggio della aorta. </li></ol></li><li> Cuore Estrazione e Incannulamento <ol><li> Somministrare eparina (5 UI / g di peso corporeo) mediante iniezione intraperitoneale. Attendere 20 minuti per permettere l&#39;eparina di circolare al cuore. </li><li> Anestetizzare il mouse per iniettare intraperitonealeione del 20% carbammato di etile (2 mg etil carbammato / g di peso corporeo). Osservare da vicino fino a quando il mouse è sotto anestesia profonda (circa 3 - 5 minuti). NOTA: l&#39;anestesia profonda è confermata da una mancanza di entrambi pizzico punta e riflessi corneali. Se il mouse non ha raggiunto l&#39;anestesia profonda da 8 - 10 min, quindi somministrare una dose aggiuntiva di carbammato di etile. Anche se le risposte individuali all&#39;anestesia varieranno tra i topi, il fallimento di entrare in profondità dell&#39;anestesia alla prima somministrazione può indicare carbammato di etile degradato, che può precludere l&#39;anestesia profondi anche dopo somministrazioni ripetute. Per evitare il degrado, preparare una soluzione fresca di carbammato di etile prima di ogni utilizzo. </li><li> Immobilizzare il mouse per la piattaforma di chirurgia, garantendo ogni arto con del nastro adesivo chirurgico. Disinfettare la zona incisione con una quantità generosa di 70% di etanolo. Pat asciugare con un laboratorio-wipe. </li><li> Sollevare la pelle con una pinza di tessuto appena sotto lo sterno. Effettuare una incisione laterale con piccole forbici, tagliando through la pelle e l&#39;addome. </li><li> Utilizzare hemostats per sollevare delicatamente la gabbia toracica tramite lo sterno. Utilizzando piccole forbici dissezione, estendere l&#39;incisione in una forma a V verso l&#39;ascelle. Tagliare prima nervatura e perforare la membrana su ogni lato. </li><li> Continuare a sollevare la cassa toracica con hemostats e utilizzare piccole forbici iris al transetto completamente il diaframma. Fare attenzione a non forare il cuore. </li><li> Ritrarre la gabbia toracica rostralmente utilizzando emostatiche annessi e rapidamente, ma si estendono attentamente l&#39;incisione a forma di V, tagliando attraverso la gabbia toracica verso il ascelle su entrambi i lati. Ritrarre la sezione centrale della cassa toracica completamente e fissare le pinze emostatiche collegati a tenere in posizione. </li><li> Rimuovere il pericardio utilizzando una pinza sottile. </li><li> Mentre delicatamente sollevare il cuore con pinze curve, transetto le vene e le arterie collegate al cuore. Subito posizionare cuore in tampone perfusione ghiacciata per rallentare la contrazione muscolare. </li><li> Mettere il cuore in una capsula di Petri sottoun microscopio dissezione (posto su un piccolo pezzo di 215 micron di maglia per aiutare immobilizzare durante la dissezione). Trim qualsiasi tessuto non-cardiaca in eccesso con iris belle forbici. Fare attenzione durante il taglio in prossimità dell&#39;aorta. </li><li> Transetto l&#39;aorta vicino l&#39;arteria brachioencephalic, e fare attenzione a non lasciare bolle o frammenti di tessuto entrano l&#39;apertura. </li><li> Riempire la capsula di Petri contenente cuore con tampone di ghiaccio freddo perfusione tale che il livello del liquido sale sopra l&#39;apertura della cannula. Guaina l&#39;aorta sulla cannula tale che la punta è appena distale alla valvola aortica. TIP: Per ridurre il rischio di embolia di aria, leggermente deprimere la siringa sulla cannula prima cannulazione per rimuovere le bolle d&#39;aria potenziali che possono essere sviluppati alla fine della cannula. Inoltre, mantenere la punta della cannula e l&#39;aorta sotto la superficie della soluzione per evitare l&#39;introduzione di bolle mentre guaina dell&#39;aorta. </li><li> Infilare un pre-legato 7-0 seta sutura giùl&#39;albero dell&#39;ago cannulazione e la posizione appena sopra la punta dell&#39;ago. Stringere il nodo con una pinza sottile. Ripetere questa operazione con un secondo di sutura posto appena sopra il primo. NOTA: Assicurarsi che la punta dell&#39;ago è ancora sopra la valvola aortica prima e dopo il serraggio. </li><li> Premere lentamente la siringa per espellere 0,5 ml di tampone perfusione attraverso il sistema vascolare coronarico. NOTA: Se la cannulazione ha avuto successo, il sangue sarà visualizzata lasciando il sistema vascolare coronarica e mettere in comune fuori delle vene dorsali e le arterie. IMPORTANTE: Il tempo di apertura della cavità toracica (in particolare, perforando la membrana) a siglare la perfusione deve essere ridotto al minimo per ridurre l&#39;esposizione ipossico e massimizzare la sopravvivenza e la salute dei cardiomiociti isolati. Idealmente, questa volta deve essere inferiore a 5 min. </li></ol></li><li> perfusione NOTA: La perfusione retrogradaapparecchiatura può essere convenientemente utilizzato in un ambiente pulito su un banco di laboratorio standard o collocato in una cappa a flusso laminare per massimizzare la sterilità. Tuttavia, dopo perfusione è completa, il lavoro deve essere eseguito sotto flusso laminare per minimizzare la contaminazione. <ol><li> Delicatamente ma con fermezza rimuovere l&#39;hub della cannula dalla siringa (usando guanti sterili) ruotando lentamente avanti e indietro. Tirando l&#39;ago cannulazione fuori della siringa, espellere lentamente buffer di perfusione nel mozzo dell&#39;ago per evitare bolle d&#39;aria durante la perfusione. </li><li> Rimuovere il tubo di ricircolo pescato da sotto la porta di uscita perfusione e sostituirlo con un bicchiere cattura dei rifiuti. Fissare il mozzo ago all&#39;adattatore luer che viene fissato alla porta di uscita di perfusione (figure 1, 2) sulla camicia d&#39;acqua, mentre la pompa è in esecuzione al livello più basso (15 giri, ~ 6 ml / min). SUGGERIMENTO: Quando si collega l&#39;hub ago all&#39;adattatore luer, permettono il buffer di perfusione stillicidio di ConNECT al liquido nel mozzo dell&#39;ago per evitare di introdurre bolle. </li><li> Profumato cuore senza ricircolo fino a 8 ml di tampone perfusione sono stati aspirati dal tubo di alimentazione. NOTA: Il volume di tampone perfusione aspirata dal tubo di alimentazione in questa fase assume un volume morto di 7 ml per il sistema di perfusione, per un totale di 15 ml di tampone perfusione pompato attraverso il cuore. </li><li> Rimuovere il tubo di ingresso dal buffer di perfusione. aria Lasciare essere aspirata dal ingresso per meno del volume morto del sistema. NOTA: Il volume di aria aspirata in questa fase deve essere regolata per evitare che l&#39;aria entri nel sistema vascolare coronarico (vedere il punto 1.3.7). </li><li> Posizionare il tubo di ingresso nel buffer di digestione (Tabella 1), appena sopra il fondo della provetta. Alimentano lentamente e permettere al tubo di ingresso per aspirare un volume sufficiente per evitare di riempire eccessivamente il tubo. </li><li> Visualizzare e seguire la bolla d&#39;aria tra ilil buffer di perfusione e il buffer di digestione mentre viaggia attraverso la camicia di calore. Osservare il livello di tampone di perfusione nel centro della giacca di calore iniziano a cadere una volta che la bolla d&#39;aria raggiunge la camera de-gorgogliamento. Quando il buffer di digestione raggiunge la camera de-gorgogliare, il livello del liquido nel rivestimento termico rimane costante. IMPORTANTE: Se il livello di buffer di perfusione scende troppo, chiudere il rubinetto di uscita e aprire il rubinetto di sfiato. Lasciare che il livello a salire ad un livello confortevole (3 - 5 pollici sopra la porta di uscita). Poi, fermare la pompa di perfusione e chiudere il rubinetto di sfiato. Aprire il rubinetto porta di uscita e riavviare la pompa di perfusione. </li><li> Vedere la soluzione che emerge dal cuore. Come ultimo del buffer di perfusione lascia il cuore e il buffer di digestione inizia circola attraverso il cuore, cambiamento di colore da chiaro a marrone chiaro sarà osservato per la presenza di collagenasi. </li><li> Profumato cuore con il tampone di digestionecirca il 10 - 15 min. Il cuore inizierà dinoccolato come il collagene è degradato e perde il supporto meccanico. </li></ol></li><li> La dissociazione meccanica e purificazione <ol><li> Rimuovere il cuore dalla cannula con una pinza e posto in una capsula di Petri a secco. tagliare rapidamente il tessuto extra-ventricolare con iris belle forbici. Trasferire i ventricoli di un piatto contenente tampone fresco petri perfusione da lavare. Spostare la capsula di Petri ad una cappa sterile e trasferire i ventricoli per un fresco, capsula di Petri a secco. </li><li> Raccogliere 7,5 ml di tampone di digestione dalla giacca fuoco e aggiungere 2,8 ml di 1 M CaCl 2, mescolare per inversione. Aggiungere 2 - 3 ml di tampone di digestione con CaCl 2 ai ventricoli nella capsula di Petri. NOTA: La concentrazione di Ca 2+ è sollevata da 300 a 700 micron </li><li> Triturare rapidamente il tessuto ventricolare con pinza sottile, in modo che la maggior parte pezzi sono inferiori a 1 mm 3. Aggiungere la rimangonoing buffer di digestione Ca 2+ integrato dal punto 1.3.2 ai ventricoli dissociate nella capsula di Petri e mescolare delicatamente agitazione. </li><li> Collocare la capsula di Petri in un incubatore a 37 ° con 5% di CO 2. Agitare la capsula di Petri ogni 2 minuti fino a quando cardiomiociti sufficienti (vedi nota sotto) sono stati rilasciati dal tessuto. NOTA: la lunghezza di incubazione può essere necessario regolare per calibrare il grado di digestione secondo le esigenze dell&#39;esperimento. In generale, tempi di incubazione più lunghi aumentare la resa e la purezza, ma può ridurre il tasso di adesione cellulare e la sopravvivenza. 5 - 10 min è generalmente sufficiente per ottenere un alto rendimento (~ 5 - 10 x 10 5 cellule per cuore). </li><li> Trasferire la capsula di Petri di nuovo ad una cappa a flusso laminare. Usando una pipetta di trasferimento tagliato a un angolo di 45 °, delicatamente pipetta il tessuto a dissociarsi ulteriormente. </li><li> Utilizzare guanti sterili per piegare la maglia 215 micron in un cono e rinviare un conica da 50 ml. Pipettala sospensione tessuto dissociato sulla maglia e consentire il filtrato affluisca nella conica 50 ml. Utilizzare 7,5 ml di tampone di arresto pre-riscaldato (Tabella 1) per lavare i cardiomiociti dalla capsula di Petri attraverso le maglie, combinandosi con il primo filtrato. NOTA: Ca 2+ è portata alla finale 1.1 mM e la finale FBS 2,5% nel buffer fermata neutralizza l&#39;attività della proteasi. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare ad una conica 15 ml e lasciar riposare per gravità per 15 min. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta di trasferimento in modo che solo 50 - 100 ml di soluzione rimane al di sopra delle celle. Aggiungere 10 ml di pre-riscaldato, terreni di coltura equilibrato (Tabella 1) e mescolare delicatamente per inversione. Lasciare le cardiomiociti di stabilirsi per gravità per 15 min. SUGGERIMENTO: Per aumentare la purezza, ripetere il punto 1.4.8 come desiderato. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta di trasferimento tale che solo 50 - 100 ml osoluzione f resterà sulle cellule. </li></ol></li></ol> 2. Cultura Cardiomyocyte <ol><li> Pre-coat tessuto cultura trattati piastre di Petri con laminina (10 mg / ml) e conservare a 37 ° C per 2 ore prima di placcatura cellule. Appena prima di placcatura, aspirare la soluzione laminina dalla piastra di coltura tissutale. Lavare una volta con MEM o PBS, quindi aspirare il liquido residuo per rimuovere laminina non assorbito. </li><li> Aggiungere abbastanza pre-riscaldato, terreni di coltura equilibrato per ottenere la densità cellulare desiderato, mescolare delicatamente per inversione. Piatto desiderata concentrazione di cellule nel recipiente di coltura (tipicamente 5 - 20 x 10 4 cellule / cm 2). Per valutare la resa di isolamento cardiomiociti, contare le cellule tramite emocitometro o test-plate controllando la densità al microscopio. Un cuore di topo adulto fornisce tipicamente 0,5 - 1,0 x 10 6 cellule in questa fase del protocollo. SUGGERIMENTO: Se si utilizza piastre a 96 pozzetti, utilizzare un micropip 1.000 mlette con una punta tagliata ad un angolo di 45 ° per ridurre al minimo i danni delle cellule a causa della forza di taglio. Posizionare la punta della pipetta tale che tocchi il fondo del pozzo durante l&#39;espulsione di sospensione cellulare in modo da minimizzare l&#39;introduzione di bolle. </li><li> Spostare il piatto di coltura cellulare prontamente a un 37 ° C incubatore con 5% di CO 2 e il 95% di umidità. Cambiare media come necessario per impedire l&#39;acidificazione: ogni 1 - 5 giorni a seconda della densità cellulare. Minimizzare la manipolazione del piatto cultura durante i primi 3 - 6 giorni per facilitare il fissaggio su una superficie di coltura cellulare. NOTA: Per ridurre al minimo disturbo delle cellule durante i cambiamenti dei media quando le cellule non hanno pienamente attaccato, effettuare un cambio semi-media. Lentamente aspirare il supporto mantenendo la punta della pipetta appena sotto la superficie del supporto. Quindi aggiungere lentamente ulteriore supporto, mantenendo la punta della pipetta appena sopra la superficie del supporto contro la parete del piatto cultura. </li><li> Per valutare la fattibilità di cardiomiociti, controllarela morfologia al microscopio campo chiaro. Appena cardiomiociti isolati mantengono una morfologia più o meno a forma di asta con taglienti, bordi distinti sotto illuminazione campo chiaro (Figura 2). NOTA: Confermare la vitalità colorando le cellule con trypan blu. </li><li> Per valutare la purezza del isolamento cardiomiociti, controllare la morfologia delle cellule per identificare i cardiomiociti. Colorare i nuclei con Hoescht 33342 per identificare le cellule totali. NOTA: cardiomiociti possono essere identificati dai non cardiomiociti dalla loro morfologia caratteristica (rod-shaped) e dimensione (circa 100 - 200 micron di lunghezza). In alternativa, cardiomiociti isolati appena si macchia positivo per i marcatori specifici cardiomiociti, come alfa-actinina 26 (Figura 3C, D) o troponina cardiaca T. 27 </li></ol> 3. trasduzione genica con Adenovirus <ol><li> Preparare adenovirus lisato cellulare utilizzando stabilito metodi. 21 trasdurre i cardiomiociti utilizzando lisato cellulare da cellule produttrici adenovirus 10. Il giorno 0 o 1 giorno dopo l&#39;isolamento, aggiungere con cautela il lisato cellulare ai media che contiene i cardiomiociti. NOTA: Una preparazione adenovirus alto titolo raggiungerà forte espressione in circa 48-72 ore. Regolare la molteplicità di infezione per soddisfare il disegno sperimentale. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La salute generale dei cardiomiociti isolati dipende da diversi aspetti importanti di questo protocollo. In primo luogo, il tempo dall&#39;estrazione cuore a perfusione è critica e deve essere eseguita in 5 minuti o meno. La rimozione di calcio aiuta a dissociarsi interazioni cellula-cellula, ma può avere un impatto negativo sulla salute delle cellule a lungo termine. 29-32 Così, troviamo sufficiente per rimuovere il calcio durante i primi pochi minuti di perfusione di EGTA (acido tetraacetico glicole etil...

Cardiomiociti in coltura sono spesso utilizzati per monitorare il comportamento delle cellule in un ambiente ben controllato in vitro. Ad esempio, le proprietà delle cellule morfologiche, elettriche, biochimici, o meccanici possono essere studiati su substrati ingegnerizzati, 1,2 in mezzi definiti, e in risposta ai farmaci piccole molecole, peptidi, regolazione genica, 3 o stimolazione elettrica. 4 Il contenuto cellulare può anche essere controllato tramite definiti co-culture. 5 Questi esperimenti in vitro sono utili per grandi schermi di droga o genetiche e si completano a metodi in vivo per i vari tipi di indagini che coinvolgono la biologia dei cardiomiociti. cultura a lungo termine consente viali sperimentali che richiedono estese periodi di tempo per realizzare il cambiamento fenotipico. Un esempio attuale è quello di adulto la proliferazione dei cardiomiociti dei mammiferi, in cui de-differenziazione, del ciclo cellulare di rientro, e la divisione cellulare è tipicamente studiati su ségiorni veral o settimane. 6,7 Qui, il tempo di cultura estesa facilita la manipolazione genetica, 7,8 de-differenziazione funzionale (ad esempio, lo smontaggio sarcomerica) 9 e de-differenziazione potenzialmente trascrizionale. 6 successiva del ciclo cellulare di rientro e la divisione cellulare richiede periodi di cultura ancora più lunghi per osservare, soprattutto se più cicli di divisione sono l&#39;obiettivo sperimentale. L&#39;importanza del ciclo cellulare cardiomiociti è centrale per molti chiave recenti lavori scientifici nella rigenerazione del cuore, dove è stato dimostrato responsabile per la rigenerazione cardiaca in zebrafish e topi neonatali il dedifferentiation e la proliferazione dei cardiomiociti preesistenti. 10-12 Così, la possibilità per stimolare dedifferentiation e del ciclo cellulare rientro in cardiomiociti adulti mammiferi rimane una questione chiave nella rigenerazione cuore umano 13-15 I n esperimenti in vitro che studiano il ciclo cellulare dei mammiferi cardiomiociti sono prevalentemente utilizzati fonti ratto, grazie alla loro relativa facilità di coltura a lungo termine rispetto ai modelli di topo. 16 Tuttavia, sistemi murini offrono una ricca fonte di strumenti transgenici ben caratterizzati e modelli di malattia che sono utili sia in vitro che in vivo protocolli. Ad esempio, lineage tracing Cre-based ha permesso l&#39;identificazione di cardiomiociti preesistenti come fonte di rigenerare miocardio nel cuore neonatale topo in vivo. 12 Studi in vitro su cardiomiociti di topo neonatali lineage tracing hanno permesso l&#39;esame delle interazioni con stromale cellule attraverso co-coltura con fibroblasti. 5 Tuttavia, a causa delle sue sfide, 17 pochi rapporti esistono di isolamento e di lungo periodo della cultura di cardiomiociti di topo adulto. 18,19 L&#39;isolamento di vitali cardiomiociti di topo adulto per la cultura a breve termine da solo è conosciuto per essere un compito impegnativo. Questo ProtoColo fornisce istruzioni passo-passo su come raggiungere cardiomiociti vitali da topi adulti che possono essere utilizzati sia per il breve termine, così come le indagini a lungo termine. Cardiomiociti isolati utilizzando questo protocollo possono essere efficacemente trasdotte con vettori adenovirali 20,21 e coltivate per settimane. Questi metodi forniscono un potente sistema per studiare la biologia dei cardiomiociti in vitro. I metodi descritti nel presente documento si basano su diversi elementi da opere precedenti utilizzando varianti della perfusione retrograda Langendorff. 18,22 Sebbene diversi protocolli sono stati pubblicati sulla isolamento di cardiomiociti di topo adulto per la cultura a breve termine e di studio, 23-25 ​​il vantaggio di questo protocollo è la capacità di cultura isolate cardiomiociti a lungo termine. Questo sarà utile nello studio dei processi cellulari in cui l&#39;espressione genica ectopica e richiedono lunghi periodi di tempo, come nelle strategie riprogrammazione cellulare.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heated water jacket</td><td>Radnoti</td><td>158831</td><td></td></tr><tr><td>Circulating heated water bath, Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>3013</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory pump</td><td>Watson-Marlow</td><td>323</td><td></td></tr><tr><td>Hemostats</td><td>Exelta</td><td>63042-090</td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps</td><td>VWR</td><td>470128034</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 curved forceps</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 fine forceps</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Small dissection scissors</td><td>VWR</td><td>470128034</td><td></td></tr><tr><td>Extra fine bonn scissors</td><td>FST</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Fine spring scissors</td><td>FST</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>S25837</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>S25414</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>86329</td><td></td></tr><tr><td>Butane dione monoxime (BDM)</td><td>Sigma</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>BP310100</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Novo Nordisk</td><td>393153</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Amresco</td><td>0732-288</td><td></td></tr><tr><td>Protease, type XIV</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>15-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS, heat inactivated</td><td>JRS</td><td>43613</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invitrogen</td><td>NC9141851</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Carbamate</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAA44804-18</td><td></td></tr><tr><td>215 micron mesh</td><td>Component supply</td><td>U-CMN-215-A</td><td></td></tr><tr><td>20 G blunt ended needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305183</td><td></td></tr><tr><td>20 G beveled needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>Lab tape</td><td>VWR</td><td>89097-990</td><td></td></tr><tr><td>Surgical tape</td><td>3M</td><td>1527-0</td><td></td></tr><tr><td>Silk suture, 7-0</td><td>Teleflex</td><td>15B051000</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-alpha-actinin antibody</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21121</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes

Cardiomiociti in coltura possono essere utilizzati per studiare la biologia dei cardiomiociti utilizzando tecniche che sono complementari ai sistemi in vivo. Ad esempio, la purezza e l&#39;accessibilità della cultura in vitro consente un controllo preciso analisi biochimiche, immagini dal vivo, e elettrofisiologia. cultura a lungo termine di cardiomiociti offre l&#39;accesso ad approcci sperimentali aggiuntivi che non possono essere completate in colture a breve termine. Ad esempio, l&#39;indagine in vitro di dedifferentiation, ciclo cellulare di rientro, e la divisione cellulare è finora stato in gran parte limitato a cardiomiociti di ratto, che sembrano essere più robusto nella cultura a lungo termine. Tuttavia, la disponibilità di un ricco set di strumenti di linee di topi transgenici e modelli di malattia ben sviluppati rendere i sistemi di mouse attrattivo per la ricerca cardiaca. Anche se diversi rapporti esistano di topo adulto isolamento dei cardiomiociti, alcuni studi dimostrano la loro cultura a lungo termine. Presentato qui, è un metodo step-by-step per laisolamento e di lungo periodo della cultura di cardiomiociti di topo adulto. Innanzitutto, retrograda perfusione Langendorff è usato per digerire efficientemente il cuore con proteasi, seguita da purificazione gravità sedimentazione. Dopo un periodo di de-differenziazione seguito isolamento, le cellule gradualmente attribuiscono alla cultura e possono essere coltivate per settimane. Adenovirus lisato cellulare viene utilizzato per trasdurre efficientemente i cardiomiociti isolati. Questi metodi forniscono un semplice, ma potente sistema modello per studiare la biologia cardiaco.

Un tipo adulto selvaggio ICR (CD1) cuore del mouse produce tipicamente 500.000 a 1 milione di cardiomiociti da un isolamento di successo. Subito dopo l&#39;isolamento, le cellule mantengono un aspetto prevalentemente a forma di asta (Figura 3A) con sarcomeri intatti e possono essere utilizzati per studi funzionali coinvolgono cardiomiociti contrattilità. Una percentuale elevata di cardiomiociti astiformi (superiori al 90%) è indice di perfusione efficace e la digestion...

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Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

26.5K Views.  University of California, San Francisco. This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability. 

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Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Ricerca

Biologia

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Cella singola Profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolamento e Cultura della neonatali mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolamento e Cultura del mouse principale acinose pancreatiche Cellule

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolamento e Cultura del topo adulto Cardiomyocytes per Cell Signaling e<em&gt; In vitro</em&gt; Cardiaca Ipertrofia

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

Un metodo semplice ed efficace per isolare in modo coerente i cardiomiociti di topo

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Medicina

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

Isolamento, trasfezione e cultura a lungo termine di cardiomiociti per topi e ratti adulti

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Isolamento simultaneo e cultura di miociti atriali, miociti ventricolari e non miociti da un cuore di topo adulto

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...